[发明专利]一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物及检测方法

说明书

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物及检测方法。本发明公开了一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物，该组合物包括用于检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA引物和探针、用于检测肝肠孢子虫的RPA引物和探针，本发明所述的多重RPA引物和探针组合物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明还公开了一种急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的同时检测的方法，该方法成本低，不依赖复杂的仪器设备、反应快速灵敏，操作简单。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物及检测方法。

背景技术

虾是一种生活饮食中常见的水产品，在全球的需求量都是非常大的，然而微生物或病毒感染引起的虾传染病对虾养殖业危害极大。在这些传染病中，急性肝胰腺坏死综合征(AHPND) 能够在虾生长至25天时开始发病，传染快速，错过早期治疗可能造成100％的死亡率。肝肠孢子虫(EHP)虽然并不致命，但是具有传播快，临床症状不明显等特点，可以使得虾产量大大下降，对养殖户造成严重的经济损失。因此肝肠孢子虫也是目前虾养殖过程中需要时刻监控的传染病之一。目前为止，关于这两种传染病并没有有效的治疗方法，只能依靠早期诊断和传统的流行病防控措施来避免经济损失，因此在养殖场实地快速，便携地检测对于监控传染病的发展非常重要。

目前关于这两种传染病的分子诊断方法有很多，例如Nested PCR，qPCR等，这些方法虽然检测灵敏，但是都存在着一定的缺点，例如设备依赖性强，检测人员要求高，并不能满足偏远地区养殖场的检测需求。而随着检测技术的不断发展，等温扩增的方法也开始出现，例如LAMP，然而它虽然是等温扩增技术，但是它依旧需要一个相对精确的温控设备来实现最佳的反应，这也使得它的发展在很多场所还是受到限制。

发明内容

本发明旨在提供一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物，该组合物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明还公开了一种急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的同时检测的方法，该方法成本低，不依赖复杂的仪器设备、反应快速灵敏，操作简单。

为了实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案：

一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物，其特征在于，所述多重RPA引物和探针组合物包括用于检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA引物和探针、用于检测肝肠孢子虫的RPA引物和探针，其中：

所述用于检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；

所述用于检测肝肠孢子虫的RPA正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ IDNO.4、 SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。

优选的，用于检测虾急性肝胰腺坏死症的探针序列的5’端用FITC标记，3'端用C3-space 进行封闭，距离5'端的30碱基距离处用四氢呋喃取代原有碱基；

用于检测肝肠孢子虫的探针序列的5'端进行DIG标记，3'端用C3-space进行封闭，距离 5'端30碱基距离处用四氢呋喃取代原有碱基；

用于检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的反向引物进行Biotin的标记。

优选的，所述多重RPA引物和探针组合物中检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA正向引物、反向引物和探针的摩尔比为1:1:0.3，所述用于检测肝肠孢子虫的RPA正向引物、反向引物和探针的摩尔比为1:1:0.3。