[发明专利]一种蜂花粉致敏蛋白的鉴定方法及应用

说明书

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种蜂花粉致敏蛋白的鉴定方法及应用。本发明所提供的蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法包括：以蜂花粉冻干粉作为鉴定样品，对样品进行蛋白抽提、蛋白酶切、肽段除盐及质谱检测鉴定；在所述蛋白抽提中，对样品与蛋白抽提剂的混合物采取间歇式超声破碎的处理手段。本发明提供的鉴定方法解决了目前蜂花粉致敏原鉴定不完善的现状；同时，本发明所述鉴定方法获得蜂花粉潜在致敏原的氨基酸序列，并分析其被T细胞和B细胞识别的抗原表位，明确致敏属性。本发明提供的鉴定方法适用于不同植物来源的蜂花粉，特别是通过该鉴定方法还进一步明确了油菜蜂花粉中5种潜在的致敏蛋白，为后续质量安全控制提供了依据。

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种蜂花粉致敏蛋白的鉴定方法及应用。

背景技术

蜂花粉因其丰富的营养价值、极高的食用和药用功效，目前已在食品、保健品、药品行业，以及畜牧养殖方面有所应用。随着蜂花粉适用范围的扩大，食用蜂花粉随即带来的安全问题也逐渐引起人们的关注。

蜂花粉来源于植物花粉，虽然经过工蜂的处理，一部分致敏物质发生改变或降解，致敏性较其植物源花粉有所改善，但数据显示，仍有一部分易感人群食用蜂花粉后产生临床过敏症状。

目前食品过敏原分析方法主要有酶联免疫法、聚合酶链法和质谱法；其中质谱法应用最为普及。如CN107064390A所述，检测方法主要分为两类：一是利用高分辨率质谱和解卷积等数据处理技术在蛋白水平进行研究；二是将蛋白酶解为肽段后进行定性和定量研究，在肽水平实现蛋白的定性和定量。第二种方法已经可以实现一次分析中同时检测多个同类型的过敏原，是当前致敏蛋白检测的主流技术。

然而，由于蜂花粉成分的特殊性，现有常规的食品致敏蛋白分析鉴定方法难以准确鉴定出蜂花粉中致敏蛋白种类，严重制约了蜂花粉的开发利用与产业发展。

发明内容

本发明的第一方面是提供一种蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法。该方法解决了一直以来蜂花粉致敏蛋白鉴定不完善的技术难题。

本发明所提供的蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法，包括：以蜂花粉冻干粉作为鉴定样品，对样品进行蛋白抽提、蛋白酶切、肽段除盐及质谱检测鉴定；其中：

在所述蛋白抽提中，对样品与蛋白抽提剂的混合物采取间歇式超声破碎的处理手段。

研究表明，提高致敏蛋白鉴定准确性除了要改进检测方法外，还需要考虑预处理程序中样品中其他成分对致敏蛋白纯化提取效果的影响。本发明研究发现，现有食品致敏蛋白鉴定方法难以应用于蜂花粉的主要原因是蜂花粉中成分复杂，其存在碳水化合物、脂类、盐类、植物色素等多种复杂成分，由于这些成分在样品处理过程中产生干扰作用，使得现有常规检测方法难以准确鉴定出其中致敏蛋白种类。

为此，本发明提出采用间歇式超声破碎的方式进行蛋白抽提，既能够保证蜂花粉冻干粉样品中致敏蛋白被充分提取，又避免蜂花粉中其他成分的过度掺杂，从而更有利于提高后续鉴定的准确性。

优选地，所述间歇式超声破碎的条件：超声3-4s，间隔3-4s，重复30-32次。

进一步优选地，所述蜂花粉冻干粉的含水率控制在7%以下，同时蜂花粉冻干粉的粒径尺寸为100~300目。通过控制蜂花粉冻干粉的含水率及粒径尺寸，可进一步提高致敏蛋白的提取率，同时又避免蜂花粉中其他成分被过度提取，影响提取质量。

所述蛋白抽提剂可通过市售购买得到；或者自制获得。

在本发明中，所述蛋白抽提剂由pH7.4的25mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、150mmol/L氯化钠、1mmol/L乙二胺四乙酸、质量分数1%乙基苯基聚乙二醇和质量分数5%甘油组成。

本发明所述的蛋白酶切包括沉淀蛋白的复溶、乙酰化反应、酶解。