[发明专利]一种蜂花粉致敏蛋白的鉴定方法及应用

权利要求书

1.一种蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法，包括：以蜂花粉冻干粉作为鉴定样品，对样品进行蛋白抽提、蛋白酶切、肽段除盐及质谱检测鉴定；其特征在于，

所述致敏蛋白为Profilin，Expansin，Prolamin，Oleosin B2和Glutaredoxin；

所述致敏蛋白Profilin的氨基酸序列为MSVTAKVTTSPLPLSSAMTVAFGLRALIFLRQYLFLSSLIFHDCFKPQEMTDIMKDFDEPGHLAPTGLFLAGLKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQSMVFGLYEEPVTPGQCNMVVERLGDYLVEQDL，代表性肽段为DFDEPGHLAPTGLFLAGLK；

所述致敏蛋白Expansin的氨基酸序列为MKLLQNIIFVQVLMMAMVIWIVPMTYGHGHGHDHGHGHGHGHHAPVAGWLDARATFYGDINGGQTHQGACGYGDLHKQGFGLATAALSTALFNNGYTCGACYEIKCANSPQWCLPGSIKITATNFCPPDPSNKKDSWCNPPQKHFDLSQPMFLKIAQYKAGVVPVRYRRVHCTKTGGVKFEIKGNPHFVMVLPYNVGGAGDIKELCIKGTKTDWIKMQKNWGQIWNSGVVMTGQCLSFRITTSDGSTKDFMDVTPTNWGFNGQAFDGKINF，代表性肽段为ATFYGDINGGQTHQGACGYGDLHK；

所述致敏蛋白Prolamin的氨基酸序列为MKNLTMLVAIILFSCYVTSQVTASDMESMPSLRSEKLEWWHYHSYPYFHPKPPQWTFPCAGGKAFPPLPAGYNHPFHPVPFHPPPVVAKCLSDCKDVKTCMADIQKAFFTHKPVIGSECCASIQKMDVDCDKTVFGAYHNPFFDYFVKLHCATKSGSTPSAPSPA，代表性肽段为AFFTHKPVIGSECCASIQK；

所述致敏蛋白Oleosin B2的氨基酸序列为QASIFSRFFRMFSFIFPFVNVIKLIIASVTSLVCLAFSCVALGGSAVALIVSTPLFIMFSPILVPATIATTLLASGLMAGTTLGLTGIGLIMGLVRTAGGVSLLQSPLRKIIVNRIKARLGGGGGGSRLARLKKILGLLNKLRGMGAGGAAAPAAEPAPAAEAAPAAEAAPAAAPAAAPAAAP，代表性肽段为TAGGVSLLQSPLR；

所述致敏蛋白Glutaredoxin的氨基酸序列为MAMQKAKEIVSGNAVVVFSKSFCPYCVRVKELLQQLGAKFIAVELDKESDGSQVQSALAEWTGQRTVPNVFIGEKHIGGCDSVTNLHRDGKLVPMLTEAGAIAATAGTTSA，代表性肽段为AKEIVSGNAVVVFSK；

在所述蛋白抽提中，对样品与蛋白抽提剂的混合物采取间歇式超声破碎的处理手段；所述蜂花粉冻干粉的含水率控制在7%以下；蜂花粉冻干粉的粒径尺寸为100~300目；

所述蛋白酶切包括沉淀蛋白的复溶；所述复溶为将蛋白抽提得到的沉淀蛋白经尿素溶液复溶，得到复溶蛋白溶液；其中，所述尿素溶液的浓度为5-6mol/L；

所述蛋白酶切包括乙酰化反应；所述乙酰化反应为，向所得复溶蛋白溶液中依次加入碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液，室温反应1~2 h，再加入碘乙酰胺溶液，室温避光反应1~2h；

其中，所述乙酰化反应的体系中，所述碳酸氢铵溶液的加入体积是尿素溶液体积的4~6倍；所述碳酸氢铵、二硫苏糖醇与碘乙酰胺的摩尔比为：（4~5）：1：5。

2.根据权利要求1所述的蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法，其特征在于，所述间歇式超声破碎的条件：超声3-4s，间隔3-4s，重复30-32次。

3.根据权利要求1所述的蜂花粉中致敏蛋白的鉴定方法，其特征在于，所述蛋白酶切包括酶解；

所述酶解采用质谱级胰酶，其用量为乙酰化反应所得蛋白溶液中蛋白质量的1/100~1/30。