[发明专利]一种乳制品前处理方法及乳制品中唾液酸的检测方法

权利要求书

1.一种乳制品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备含有唾液酸的乳制品样品溶液；

(2)取步骤(1)中制备得到的样品溶液进行超滤离心，取下层清液加入DMB试剂，荧光衍生后得到样品溶液A；

(3)取步骤(1)中制备得到的样品溶液加入三氯乙酸，冰水浴后出现蛋白沉淀，将出现蛋白沉淀的样品溶液进行超滤离心，得到蛋白沉淀；向蛋白沉淀中加入酸水解试剂，加热水解后迅速冷却，得到水解液A；取水解液A加入DMB试剂，荧光衍生后得到样品溶液B；

(4)取步骤(3)中离心后的上清液，加入酸水解试剂，加热水解后迅速冷却，得到水解液B；取水解液B加入DMB试剂，荧光衍生后得到样品溶液C；

(5)取步骤(1)中制备得到的样品溶液，加入DMB试剂荧光衍生后，超滤离心得到样品溶液D。

2.如权利要求1所述的乳制品前处理方法，其特征在于，所述步骤(1)中，乳制品样品溶液的制备方法为：将不添加唾液酸的乳制品，加入唾液酸，喷干制成乳制品粉末；唾液酸的质量百分含量为乳制品粉末的0.1-0.5％；乳制品粉末加水溶解，得到样品溶液。

3.如权利要求1所述的乳制品前处理方法，其特征在于，所述步骤(2)中，超滤离心所用的超滤离心管的膜孔径为2000-4000DA，超滤离心的温度为3-5℃，超滤离心的离心力为3000-5000g，超滤离心的时间为10-20min；下层清液和DMB试剂的体积比为：下层清液：DMB试剂＝1：1-3。

4.如权利要求1所述的乳制品前处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中，三氯乙酸在样品溶液中的体积百分含量为15-25％；冰水浴的时间为10-15min；超滤离心所用的超滤离心管的膜孔径为2000-4000DA，超滤离心的温度为3-5℃，超滤离心的离心力为3000-5000g，超滤离心的时间为10-20min。

5.如权利要求1所述的乳制品前处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中，蛋白沉淀和酸水解试剂的质量体积比为：蛋白沉淀：酸水解试剂＝1：50-70；加热水解的温度为70-90℃，加热水解的时间为1.5-3.5h；水解液A和DMB试剂的体积比为：水解液A：DMB试剂＝1:1。

6.如权利要求1所述的乳制品前处理方法，其特征在于，所述步骤(4)中，上清液和酸水解试剂的体积比为：上清液：酸水解试剂＝1:1；加热水解的温度为70-90℃，加热水解的时间为1.5-3.5h；水解液B和DMB试剂的体积比为：水解液B：DMB试剂＝1:1。

7.如权利要求1所述的乳制品前处理方法，其特征在于，所述步骤(5)中，样品溶液和DMB试剂的体积比为：样品溶液：DMB试剂＝1:1。

8.如权利要求1所述的乳制品前处理方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)中，酸水解试剂包含甲酸、乙酸、盐酸、硫酸、硝酸中的至少一种，酸水解试剂的摩尔浓度为1-3M；所述步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)中，荧光衍生的温度为70-90℃，荧光衍生的时间为40-60min。

9.一种乳制品中唾液酸的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的乳制品前处理方法进行前处理后，进行检测。

10.如权利要求9所述的乳制品中唾液酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)绘制标准曲线；

(b)乳制品的前处理；

(c)色谱分离检测条件及出峰时间；

流动相：A：0.05％乙酸水，B：纯甲醇，试剂为HPLC色谱纯；洗脱方式为线性梯度洗脱：在2min内甲醇由初始的35％降至20％，保持3.5min后再返回至初始的35％；进样量：10μl；流速：0.8-1.0mL/min，柱温：25-30℃；检测器为荧光检测器，发射波长448nm，激发波长373nm，响应时间1.5s，采样频率2HZ。