[发明专利]一种腺苷参与的全酶法NMN合成方法

说明书

本发明公开了一种腺苷参与的NMN的全酶法合成方法，所述腺苷参与的NMN的全酶法合成方法包括同一反应体系下的步骤：(A)腺苷、磷酸盐以及可被酵母细胞代谢的糖类在酵母细胞的催化作用下反应生成ATP；(B)酶促反应生产NMN的步骤，包括在NAMPT作用下，烟酰胺、PRPP以及ATP反应生成NMN、ADP以及磷酸盐的步骤；如此以将ATP的生成(再生)、NMN的合成及ATP的利用等一系列反应统一在一个反应体系内进行，即可完成NMN的高效合成，该方法的优点是安全、环保与低成本优势。

技术领域

本发明涉及β-烟酰胺单核苷酸（NMN）合成技术领域，特别涉及一种腺苷参与的全酶法NMN合成方法。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸（NMN）是肌体合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的直接前体，补充NMN是提升肌体NAD的含量水平的最有效途径，这对于促进肌体正常的新陈代谢具有广泛而深远的健康意义。因为长者NAD水平减少，而从食物中不能获得足够的NMN，故而NMN有望成为大规模应用的膳食补充剂。

目前，NMN的现有合成技术有发酵法、化学合成法、半合成法及全酶法四种方法。其中发酵法需要构建产生NMN微生物菌种，在此微生物大量培养繁殖的过程中，由菌体细胞合成NMN。由于各个物种包括低等的单细胞生物体内催化合成NMN的关键酶（NAMPT，烟酰胺磷酸核糖转移酶）的基础活性都普遍很低，使构建高效表达NMN的菌种异常困难，又因为NMN的合成路线长，涉及多酶体系及天然的分解酶系统，所以高效大规模的发酵法生产NMN的生产方法十分困难，工艺成本高，产品没有市场竞争力。化学合成法是以烟酰胺（或烟酸）、四乙酰核糖、三苯氧磷等基础原料，用化学方法先合成烟酰胺核糖（NR），再进一步将NR磷酸化得到NMN。该方法的主要问题在于第二步的化学磷酸化步骤涉及易燃易爆及剧毒，大规模产业化面临严重的环保与安监问题，也存在化学对映体杂质及毒性原料及溶剂残留等问题，其产品长期人体应用的安全性疑虑是面对消费者难以消除的问题。半合成法是在化学合成NR的基础上用酶法使NR磷酸化而得到NMN，该方法兼具化学法及酶法的优缺点，其主要问题是既有化学法的溶剂及毒性成分残留风险，酶法磷酸化步骤也需要昂贵的三磷酸腺苷（ATP），成本较高。全酶法是用烟酰胺、核糖及ATP等为基础原料，用一系列酶的连环催化形成NMN。该方法优势在环保与安全，难点在于涉及多种酶的表达、纯化与固定化，酶的成本高；全酶法的另一大问题是ATP的用量太大，这是导致该方法成本过高，不能推广使用的主要因素。

现有四种NMN的合成方法中，全酶法是肌体天然的合成方法，在安全与环保方面的优势是显而易见的，如果设法适当降低其制造成本，全酶法应该是最具市场竞争力的方法。该方法是以烟酰胺、核糖、ATP等为主要原料，经历三步酶促反应生产NMN：①核糖激酶（RK）催化核糖转化为5-磷酸核糖，②5-磷酸核糖在磷酸核糖焦磷酸转移酶（RPPK）的催化下转化为5-磷酸核糖1-焦磷酸（PRPP），③PRPP与烟酰胺（NAM）在烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的作用下结合生成NMN。全酶法的这三步反应都需要消耗ATP，ATP在前两步反应是作为底物参与提供磷酸基团，产物分别是ADP和AMP；ATP在第三步反应是水解提供能量，产物是ADP与磷酸盐。ATP的价格昂贵，为了减少ATP的用量，生产实践中还需偶联ATP重复利用的酶促反应：AMP → ADP → ATP，这两步反应需要两个特定的酶催化，需要多磷酸盐（焦磷酸盐或三聚磷酸盐或六偏磷酸盐等）为底物提供磷酸基团，产物除了ATP，也有磷酸盐的累积。大量磷酸盐的累积会对后续反应产生影响，所以工艺过程设置有磷酸盐的去除步骤，这一步骤也影响ATP的回收率。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种腺苷参与的全酶法NMN合成方法，其中所述腺苷参与的全酶法NMN合成方法相对于现有的全酶法在维持现有全酶法的优势的同时，能够简化NMN产品的纯化工艺和降低原料成本而具有较低的生产成本。