[发明专利]一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法

说明书

本发明涉及一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法，使用羰基还原酶催化(S)‑叔丁基(4‑氯‑3‑羰基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯不对称还原制备光学活性叔丁基((2S,3R)‑4‑氯‑3‑羟基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯，葡萄糖脱氢酶提供辅酶循环，酶促反应是在连续流微反应器中发生。与现有技术相比，本发明提供了一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法，可在连续流微反应器中立体选择性催化(S)‑叔丁基(4‑氯‑3‑羰基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯的不对称还原，生成相应的光学活性叔丁基((2S,3R)‑4‑氯‑3‑羟基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯，反应条件温和，催化效率高，转化率高，产品光学纯度好，ee值可高于98.3％，具有很好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法。

背景技术

阿扎那韦是蛋白酶抑制剂(PI)类的抗逆转录病毒药物，像其他抗逆转录病毒一样，它可以用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染。该药物是国际抗病毒协会-美国专家小组推荐的用于治疗成人HIV感染的常用抗HIV药物，它被认为是一种有效的每日服用一次的药物，治疗两种不同类型的患者都有功效。其中阿扎那韦的中间体是叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，这是一个带两个手性中心的化合物，环化后用于生产阿扎那韦。阿扎那韦的化学合成路线如图1所示。

1997年，Chen等人描述了从受保护的氨基酸酯制备α-N-BOC-环氧化物的实用方法。该方法可以容易地大规模进行并且无需使用危险试剂，并且可以制备千克级别的α-N-BOC-环氧化物。该反应步骤中，其中间产物氯醇是通过氨基酸酯的两步化学法合成的，反应条件比较苛刻，在-78℃条件下进行(Tetrahedron Lett,1997,38(18):3175-3178)。2009年，Alanvert等人介绍了一种使用羰基还原酶生物催化还原α-卤代酮为相应的α-卤代醇的方法，并且其立体选择性较高。10g规模制备叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，反应21h，反应的转化率大于98.5％，de(2S,3R)＞98.5％(Tetrahedron-Asymmetry,2009,20(21):2462-2466)。2019年，Wu等人对来自Novosphingobiumaromaticivorans的短链脱氢酶NaSDR进行了研究，其对底物氯酮表现出优异的立体选择性，但活性相对较低。于是对NaSDR活性口袋上的位点进行迭代饱和诱变(ISM)，获得突变体muSDR(G141A/I195L)的催化效率显著提高，其对底物氯酮的k_cat增加到4.11s^-1，是WT(1.15s^-1)的3.57倍。制备实验反应总体积500mL，底物氯酮浓度为150g/L，反应20h后，成功催化还原获得产物氯醇，de(2S,3R)99％，重结晶后产物的纯度为99.5％，产率为85.3％(获得氯醇64.6g)(Appl Microbiol Biotechnol,2019,103(11):4417-4427)。

综上所述，叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯可以通过生物催化方法获得，非对映选择性优异；但是大多是报导的是利用机械搅拌发生酶促反应，反应效率较低。

发明内容

针对目前存在许多生物法制备光学活性手性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯效率较低的现状，本发明提供一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法。

本发明通过一种来源于酿酒酵母S288C(Saccharomyces cerevisiae S288C)的羰基还原酶作为催化剂催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原，该反应是在微反应器中进行，由两个平流泵同时工作，制备手性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：