[发明专利]一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法

权利要求书

1.一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：包括步骤

S1.纯化鸡EZH2原核蛋白，得到含有纯化的His标签EZH2蛋白样品；

S2.将纯化后的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养，测定EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增殖的影响；

S3.在步骤S2的基础上，于不同时间点提取细胞总RNA，检测MDV相关基因Meq、gB的表达水平并进行分析，测定EZH2原核表达蛋白对MDV相关基因Meq、gB的表达水平的影响。

2.根据权利要求1所述的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：步骤S1所述的鸡EZH2原核蛋白纯化的过程包括：

S101.将含有鸡EZH2原核表达载体的大肠杆菌Rosetta用1mmol诱导剂IPTG、29℃、诱导培养8h，收集细菌沉淀并称重，按每克细菌沉淀的湿重加入4ml非变性裂解液的比例加入非变性裂解液；

S102.加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，然后充分混匀，冰水浴30min；

S103.冰上超声裂解细菌，4℃、10000g下离心30min，将离心后的上清收于EP管中置于冰水浴或冰上；

S104.取1ml混合均匀的50％BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin，4℃离心后弃去储存液，向纯化柱中的凝胶中加入0.5ml非变性裂解液，4℃离心弃平衡液，重复平衡2-3次之后加入细菌裂解液上清；

S105.将穿流液收集并重复上柱3-5次；

S106.然后取下纯化柱底部的盖子，使柱内液体由于重力的影响自然流出；

S107.每次加入非变性洗涤液0.5ml，之后连续洗柱5-6次，每次收集洗涤液20ul；

S108.最后把目的蛋白洗脱6-10次，每次都用非变性洗脱液0.5ml进行洗脱，得到含有纯化的His标签EZH2蛋白样品。

3.根据权利要求1所述的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：步骤S2所述的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养的具体应用过程包括：

S201.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至5.0×10⁵个/mL，并取100μL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度分别为10、20、40、50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复，并设不含抗体的正常细胞培养对照，轻轻摇晃混匀；

S202.在37℃细胞培养箱中培养24h、48h后每孔加入CCK-8试剂10μl，继续培养4h后，空白对照调零，酶标仪上测OD₄₅₀。

4.根据权利要求1所述的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：步骤S3所述的鸡EZH2原核表达蛋白应用在MDV相关基因中的具体过程包括：

S301.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至1.0×10⁶个/mL，并取1mL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度为50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复；

S302.继续培养24h和48h后，收集细胞，提取MSB1细胞总RNA；

S303.利用实时荧光定量PCR方法检测MDV相关基因表达。