[发明专利]基于RAA扩增和CRISPR-Cas13a系统的SARS-CoV-2核酸检测方法

说明书

本发明提供了一种crRNA分子及用于CRISPR‑Cas13a检测SARS‑CoV‑2核酸的方法。本发明提供的方法简便、易行、快速，当结合重组酶聚合酶核酸扩增技术时，灵敏度为500拷贝/mL，显示出了极高的灵敏度。在实际应用中，检测灵敏度为98.00％，特异度为100.00％，阳性预测值为100.00％，阴性预测值为98.04％，能有效检出新型冠状病毒的核酸样本。

技术领域

本发明涉及一种病毒核酸的检测方法，属于微生物检测应用领域。

背景技术

新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2，SARS-CoV-2)是单股正链RNA病毒，其功能性编码基因包括开放阅读框1ab基因(Open ReadingFrame 1ab，ORF1ab)、刺突蛋白基因(Spike protein，S)、包膜蛋白基因(Envelopeprotein，E)、膜蛋白基因(Membrane，M)和核蛋白基因(Nucleocapsid，N)。感染人体后可造成新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，患者出现发热、咳嗽、胸闷、乏力等流感样症状，严重者可出现呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。新型冠状肺炎的传染源为新冠病毒感染者，通过呼吸道飞沫，直接接触新冠病毒污染物，粪口途径等多种途径在人群中迅速传播，所有人群均易感。目前，新型冠状病毒的检测和确诊方法有：核酸检测法、免疫学检测方法和病毒分离培养，其中核酸检测是认可度最高的检测方法。

CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated gene)全称为“簇状、规律间隔的、短回文重复序列”，该系统首先在大肠杆菌中被发现。随着对CRISPR-Cas系统作用机制和Cas蛋白功能的逐步揭示，研究人员发现该系统具有强大和广泛的应用潜力，如：作为基因编辑工具，调节基因表达，用于核酸检测和诊断，核酸成像技术，对细菌进行快速分子分型等。新发现的Cas13a系统可用于核酸检测，实现病原体的快速诊断。CRISPR-Cas13a系统用于核酸检测的原理为：Cas13a蛋白首先与相应的crRNA结合形成Cas13a-crRNA复合体，目标RNA存在时，crRNA的中心种子区先与目标RNA互补结合，随后延伸到两端。目标RNA与crRNA的复合物可诱导Cas13a蛋白的高等真核生物和原核生物核苷酸结合(Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding，HEPN)结构域相互靠近，产生活性的HEPN催化位点，Cas13a蛋白的RNA酶活性激活，可剪切任何暴露的RNA分子，包括与Cas13a-crRNA复合体结合的目标RNA和任何游离的RNA分子。基于该原理，将RNA制备成荧光淬灭探针，通过监测荧光信号的释放实现对目标RNA序列的特异性检测。然而，使用单一的CRISPR-Cas核酸检测的灵敏度非常有限，通常将核酸扩增技术与该检测技术联合应用，可大幅度提高检测的灵敏度。

常用的核酸扩增方法有：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR),重组酶聚合酶核酸扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA或Recombinase-aidAmplification，RAA)，环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)等。其中RAA可在较低温度下(37～42℃)，短时间内完成核酸扩增反应，具有操作简便、快速、灵敏度高和特异性强的特点，在病原的快速检测领域有很大的应用潜力。

本发明的目的是基于CRISPR-Cas系统，结合RT-RAA/RAA恒温扩增与CRISPR荧光检测方法，提供一种可以快速检测新型冠状病毒的高灵敏、高特异的核酸检测方法。

发明内容