[发明专利]一种检测GII型诺如病毒的巢式PCR引物及其应用

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，公开了一种GII型诺如病毒特异性检测的巢式PCR通用型引物，以及检测方法和试剂盒。本发明引物的覆盖度好，并且在特异性方面优于现有的引物。在实际检测牡蛎样品中GII型诺如病毒时，有效避免了牡蛎样品本底基因的影响，显著提高了结果的准确性。同时，与现有的经典引物相比，在实际检测牡蛎样品中GII型诺如病毒时，阳性率有提高，避免了检测中假阴性的情况；而且避免假阳性。本发明显著提高了检测牡蛎中诺如病毒的准确性，操作更为简便，为以后检测牡蛎中的诺如病毒提供了便利。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是病毒检测技术领域。具体的说，是一种GII型诺如病毒特异性检测的巢式PCR通用型引物及其应用，尤其是用于牡蛎中GII型诺如病毒的检测。

背景技术

诺如病毒(Norovirus)是引起人类非细菌性急性肠胃炎的主要原因之一，在世界范围内均有发生，在全球造成经济的重大损失。

诺如病毒基因组为单股正链RNA，全长约7.6kb，具有无包膜的二十面体对称结构。大多数诺如病毒的基因组分为三个ORF(Open Reading Frame,ORFs)。ORF1从N到C端编码6个非结构蛋白，依次为p48、NTPase、p22、VPg、3CLpro和RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)；ORF2编码主要衣壳蛋白VP1；ORF3编码次要结构蛋白VP2。

2019年世界杯状病毒研究小组更新了以RdRp核酸序列和完整的VP1氨基酸序列的双分型方法。基于VP1氨基酸序列的多样性，诺如病毒属扩大到十个基因群(GI-GX)，进一步划分为49个基因型(9个GI，27个GII，3个GIII，2个GIV，2个GV，2个GVI和GVII，GVIII，GIX[以前GII.15]，GX各一个)；以及两个暂定的新基因群GNA1和GNA2。根据部分RdRp区核苷酸序列可进一步划分为60个P型基因类群(14个GI，37个GII，2个GIII，1个GIV，2个GV，2个GVI，1个GVII和1个GX)和2个暂定P组和14个暂定P型。GI、GII、GIV、GVIII、GIX与人类疾病密切相关，其中GI、GII为感染人类的两个主要类群。

诺如病毒具有较低的感染剂量，可通过粪口途径(食用被污染的食物或水)、气溶胶及接触其他污染物等途径进行传播，食用加热不彻底的牡蛎等双壳牡蛎也会增加诺如病毒的感染率。在2006-2016年间，中国地区报道的132起诺如病毒疫情中，有82％的案例都是由GII型诺如病毒引起的。

牡蛎作为滤食性动物，以水中的微型海藻和有机碎屑为食，它能将周围水中的组织颗粒浓缩四倍以上。大量研究证实，超过80％的人诺如病毒存在于牡蛎中或牡蛎相关样本。因此，牡蛎中GII型诺如病毒准确的检测对于相关环境的监测和疾病的预防是至关重要的。

巢式RT-PCR使用两对引物进行目的片段的扩增，自2002年KOJIMA等基于GII型诺如病毒衣壳蛋白基因(VP1)设计了两对引物对(RT-PCR引物COG2F/G2SKR，Nested-PCR引物即巢式PCR引物G2SKF/G2SKR)，广泛应用于粪便样品中GII型诺如病毒的检测，至今已有二十年左右。然而，诺如病毒变异快，每2-3年就会出现新毒株，诺如病毒的基因型和序列也在不多增加，引物的覆盖率和特异性也是值得关注的。此外，近年来研究发现将这两对引物用于牡蛎中诺如病毒检测时经常出现大小不一的非特异性PCR产物，GUO等(Guo,P.；Yu,Y.；Pan,Y.；Yan,S.；Wang,Y.,Design and evaluation of nested PCR primers forspecific detection of genogroup I noroviruses in oysters.Molecular andCellular Probes 2018,40,40-43)证实了这些非特异性序列多源于牡蛎本身或其肠道细菌的基因，说明现有的巢式PCR引物在应用于牡蛎中诺如病毒检测时容易受样品本底基因影响，影响结果的准确性并大大加重了工作负担和检测成本。