[发明专利]一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法

说明书

本发明公开了一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，包括以下步骤：(1)基质样品前处理；(2)蛋白质提取和纯化；(3)蛋白水解和(4)肽段样品纯化，最终酶解后的肽段样品经过纯化和冻干后，得到蛋白样品，在蛋白质提取和纯化步骤中，同时沉淀水相和有机相中蛋白含量，减少亲水性蛋白损失，本发明有效的解决了现有技术中亲水性的蛋白的损失，提高了蛋白质组样品中蛋白质丰富度；同时解决了目前宏蛋白质组学研究环境微生物样品重复性差导致的蛋白定性定量出现较大偏差的问题，提高了蛋白质鉴定的重现性。

技术领域

本发明涉及一种制备宏蛋白质组样品的方法，尤其涉及一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，属于蛋白组学领域。

背景技术

随着近年来高分辨率质谱技术的飞速发展，蛋白质组学得以进步和广泛应用。一方面，相比于蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法，蛋白质组学方法能够高通量地获得样品中成百上千种蛋白质的信息，而且能够应用于检测未知的蛋白物质。另一方面，相比基于DNA测序技术的基因组学和转录组学，基于高分辨率质谱技术的蛋白质组学更能直接反映特定条件下微生物群落的物种组成和功能特征。蛋白质组学涉及的步骤包括样品中总蛋白的提取和纯化，纯化蛋白的处理和酶解，超高效液相色谱和高分辨率质谱联用检测，蛋白质的搜库鉴定及后续生物信息学分析。

专利公开号为CN107167353B的申请公开了一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法。该样品处理方法涉及到多步提取和纯化步骤如震荡破碎、超声、离心、冷丙酮沉淀和酶解等过程。另外，公开专利号为CN109810168A的申请公开了一种多级蛋白提取的方法用于提取土壤中的总蛋白。该方案涉及到分别用柠檬酸，十二烷基磺酸钠，柠檬酸蛋白提取液对土壤进行三次提取，然后利用Tris-饱和酚进行液液萃取富集蛋白质。

现有方法涉及的步骤繁杂，且未考虑并解决环境基质中微生物蛋白质样品制备的重复性差的问题，经过有机相即饱和苯酚萃取后，提取蛋白时所用水相被直接舍弃，大部分亲水性的蛋白可能因此损失，造成最后蛋白鉴定结果的与实际蛋白量的偏差。

发明内容

发明目的：本发明通过提供一种制备环境基质中微生物宏蛋白质组样品的方法，有效的解决了现有技术中亲水性的蛋白的损失，提高蛋白质组样品中蛋白质丰富度；同时解决了目前宏蛋白质组学研究环境微生物样品重复性差导致的蛋白定性定量出现较大偏差的问题，提高蛋白质鉴定的重现性。

技术方案：本发明所述的蛋白质组样品的方法，包括以下步骤：

(1)基质样品前处理：将基质样品在液氮中猝灭后，在液氮环境中加入研磨助剂研磨，得到粉末状基质样品，向所述粉末状基质样品中加入裂解液和提取液，并经过离心后，得到下层为有机相、上层为水相的分层混合液；

(2)蛋白质提取和纯化：分别吸出所述步骤(1)中所述有机相和所述水相，并在所述有机相和所述水相中分别加入蛋白沉淀剂，所述蛋白沉淀剂用以将所述有机相和所述水相中的蛋白质沉淀，沉淀后的有机相和水相经过离心后，分离出沉淀A和沉淀B；混合沉淀A和沉淀B得到沉淀C；

(3)蛋白水解：向所述步骤(2)中的所述沉淀C中加入蛋白溶解液进行蛋白溶解，经离心后，弃去沉淀，保留上清液，所述上清液中加入蛋白酶解液，得到酶解后的肽段样品；

(4)肽段样品纯化：所述步骤(3)中酶解后的肽段样品经过纯化和冻干后，得到蛋白样品。

进一步地，在所述步骤(1)前还包括器材预钝化处理步骤，将制备蛋白质组样品所用的器材置于预钝化处理水溶液中，浸泡6-12小时。

进一步地，所述预钝化处理水溶液，化学成分以物质量浓度计包括：吐温-20：0.02-0.10mol/L，月桂基硫酸铵：0.10-0.50mol/L，十二烷基磺酸钠：0.05-0.20mol/L，脱氧胆酸：10-30m mol/L。