[发明专利]一种新型p53蛋白激酶的非同位素筛选方法及其应用

说明书

本发明公开了一种新型p53蛋白激酶的非同位素筛选方法及其应用。本发明采用激酶反应液实现了利用非同位素标记的ATP为p53的磷酸化修饰反应提供磷酸基团，避免了采用同位素标记的ATP对实验人员的辐射损伤以及对环境的污染危害。另外，本发明利用western blot即可直接观察磷酸化修饰反应结果，实验操作简单易行。利用本发明的方法及激酶反应液揭示了PERK作为p53上游蛋白激酶的新功能。因此，本发明能够应用于筛选“有效诱导表达野生型p53的肿瘤细胞凋亡反应”的p53蛋白激酶及相关信号分子，并在寻找新型肿瘤治疗策略中具潜在应用价值。

技术领域

本发明涉及生物医学领域中，一种新型p53蛋白激酶的非同位素筛选方法及其应用。

背景技术

p53为公认的肿瘤抑制因子(tumor suppressor)，其基因突变、缺失或蛋白活性丧失是肿瘤形成的关键贡献因素。p53的功能本质是一种转录因子，它可以通过与其靶基因启动子区的p53反应成分(p53-RE)结合进而调控近三百种靶基因的表达。p53的功能主要体现为调节DNA损伤修复、细胞周期行进、细胞凋亡、细胞代谢等。如果p53功能丧失，细胞内的DNA损伤无法得到及时修复，同时p53对细胞周期行进的监视作用消失，这会导致含有受损DNA的细胞仍然能够进入正常细胞周期并由此促进肿瘤发生。目前发现：人类50％以上的肿瘤都与p53功能缺失密切相关，包括肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等。因此研究者推测：能够重新激活p53肿瘤抑制能力的分子可能具有强大的抗癌活性。

p53的诱导活化需经历一系列的翻译后修饰反应，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等。其中p53 N端Ser15位的磷酸化修饰反应是p53蛋白实现诱导活化的标志性事件。已知的多种p53蛋白激酶(如ATR、ATM、CHK1、LKB1等)都具有催化p53-Ser15磷酸化修饰反应进而活化p53并诱发细胞凋亡的功能。

PERK是定位于内质网的一种重要的内质网应激感应蛋白(ER stress sensor),其经典功能为感受内质网内的异常变化并促发后续的内质网应激反应。由于目前人们对于激酶PERK的底物分子识别序列还没有清晰认识，导致至今为止只发现了两种激酶PERK的底物分子(eIF2ɑ和NRF2)，极大地限制了PERK功能机制的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定蛋白激酶。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种鉴定蛋白激酶的方法，所述方法包括：将待测蛋白质在激酶反应液(记为激酶反应液1)中与底物进行反应；所述激酶反应液1由溶剂和溶质组成，所述溶剂为HEPES缓冲液(50mM，pH8)或50mM Tris-HCl(pH8)缓冲液，所述溶质及其在所述激酶反应液1中的浓度分别为MgCl₂ 10mM，乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸2.5mM，ATP 200μM；

所述HEPES缓冲液(50mM，pH8)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及在所述HEPES缓冲液(50mM，pH8)中的浓度分别为50mM HEPES以及调节pH至8的NaOH；

所述50mM Tris-HCl(pH8)缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述50mM Tris-HCl(pH8)缓冲液中的浓度分别为50mM Tris与调节pH至8的HCl。

本发明还提供了另一种鉴定蛋白激酶的方法，所述方法包括将待测蛋白质在激酶反应液(记为激酶反应液2)中与底物进行反应；所述激酶反应液2由溶剂和溶质组成，所述溶剂为所述HEPES缓冲液(50mM，pH8)或所述50mM Tris-HCl(pH8)缓冲液，所述溶质及其在所述激酶反应液2中的浓度分别为MgCl₂ 10mM，2.5mM乙二胺四乙酸，1mM DTT，ATP 200μM。