[发明专利]一种用于蛙病毒检测的引物及其应用

说明书

本发明针对蛙病毒3型(FV3)核衣壳蛋白(MCP)基因保守区设计一对特异性引物，通过反应体系的优化、反应特异性和敏感性试验，建立了一种针对FV3的PCR检测方法，该方法最低检测限可达1.2拷贝数的病毒粒子，具有简便、快速、敏感度好、特异性高、低成本等特点，可用于FV3蛙病毒的快速诊断快速检出和分子流行病学调研。

技术领域

本发明属于水生生物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种用于蛙病毒检测的引物及其应用。

背景技术

蛙病毒被称为冷血动物杀手，宿主范围广泛，迄今发现可感染鱼类、两栖类、爬行类等近百种水生生物，给水产养殖业造成重大经济损失。2009年，世界动物卫生组织(OIE)正式将蛙病毒感染列入必须报告的水生动物疫病之一。我国每年由蛙病毒所致的水产病害损失就高达数十亿元。我国自1996年分离获得蛙病毒属模式株蛙病毒3型(Frog virus 3，FV3)以来，蛙病毒在各地陆续被发现和报道。2013年，湖北宜昌某石蛙养殖场曾发生大规模FV3感染，主要临床症状表现为体表出血、后肢溃疡、活动无力、发病7天后达到死亡高峰，累积死亡率最高可到80％。随后，2016年四川某黑斑蛙养殖场爆发FV3感染，死亡率高达90％。蛙病毒已经成为危害我国蛙类养殖的流行性致病因素。目前对于蛙病毒感染，尚缺乏有效治疗手段，主要以早期诊断预防为主。因此，建立快速、灵敏、高效的蛙病毒检测方法，及时发现病原体并进行早期防控，是控制蛙病毒感染的重要手段。

MCP是虹彩病毒的主要组成部分，约占整个病毒多肽的40％-45％，并且在虹彩病毒科中高度保守，可利用其同源性的差异进行病毒进化与检测方面的研究，当前许多关于蛙病毒的检测方法都是基于MCP序列设计引物。王庆等根据MCP中的保守序列设计特异性引物，利用双重PCR方法特异性扩增LMBV，而对FV3不进行扩增，最低检测限达6.5pg。李江宇等通过对蛙病毒属MCP进行分析，建立了一种可用于检测蛙病毒属13种病毒成员并能进行初步分类的三重荧光PCR方法，该方法中，对各种蛙病毒的检测限均达到了10²拷贝。张旻等利用STIV的MCP设计特异性引物，建立了特异性检测EHNV和TFV的巢式PCR方法，可检测10²拷贝数的病毒粒子。以上方法虽极大地推动了蛙病毒检测研究，但双重PCR、三重PCR操作较为繁琐，易发生气溶胶污染产生假阳性，且检测耗时久；荧光PCR方法又对仪器设备要求高，引物成本也相对较高，在蛙病毒的检测应用中有一定的局限性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明针对蛙病毒属FV3病毒MCP序列设计特异性引物，仅使用一般的PCR方法就能达到较好的检测效果，对设备要求低，反应时间短，操作简单成本低，且特异性好，对TiLV,NVV,ISKNV,KHV,IHHNV,MSRV,MrNV,LMBV等其他毒株无交叉反应，灵敏度高，检测限可达1.2个拷贝数，可为蛙病毒的快速检出和分子流行病学调查提供有效技术手段。

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于蛙病毒检测的引物，所述的引物的序列如下所示：

FV3-1-5’：CCTCCATCCCAGTCAGCA；SEQ:ID:NO:1；

FV3-1-3’：CAGCAAACGGACACTTCAT；SEQ:ID:NO:2。

本发明还提供了一种上述引物的应用方法，一种蛙病毒的检测方法，其步骤如下：

(1)待测样品DNA的提取；

(2)PCR扩增：利用权利要求1所述引物进行扩增；

(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小；

(4)结果与判定：查看PCR产物是否扩出蛙病毒346bp的MCP基因保守区的片段。