[发明专利]一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，其特征在于，所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP；

该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP。

2.根据权利要求1所述的一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，其特征在于：所述的Makona GP蛋白基因序列为合成基因序列，其以EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成，并在在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列；其3’→5’的顺序为：

TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC。

3.权利要求1所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其步骤如下：

(1)根据合成的Makona GP蛋白基因序列，以VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG插入位点Nhe I序列为同源臂，设计用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物F1-F和F1-R；

(2)用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG，胶回收纯化线性载体；

(3)采用PCR方法，以合成的Makona GP蛋白基因为模板，用引物F1-F和F1-R扩增MakonaGP基因，胶回收纯化Makona GP基因；

(4)将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI-RzVSVΔG的Nhe I位点，构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP；

(5)将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L，采用脂质体转染的方法共转染宿主细胞；

(6)培养步骤(5)所述的宿主细胞2～4代；

(7)收获步骤(6)所述细胞释放的病毒，即为表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP。

4.根据权利要求3所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其特征在于：所述的引物F1-F和F1-R序列如下，

5.根据权利要求3或4所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤所述的(5)中的宿主细胞为HEK293细胞。

6.根据权利要求3或4或5任意一项所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤所述的(6)中的培养宿主细胞方法为：

HEK293细胞共转染重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L 48h后，更换培养基，5％CO₂、37℃继续培养直至出现细胞圆缩病变，收获培养物上清；培养物上清10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞，连续接种2～4代后，收获Vero E6细胞释放的病毒。

7.根据权利要求3或4或5任意一项所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其特征在于：所述的培养基为含10％胎牛血清的DMEM。

8.一种埃博拉病毒病疫苗，其含有根据权利要求1～3中任一项所述的病毒和药学上可接受的载剂。

9.根据权利要求1～3中任一项所述的重组病毒的用途，其特征在于：重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用；

重组病毒在制备抗埃博拉GP蛋白血清中的应用。

10.根据权利要求1～3中任一项所述的重组病毒的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；

所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中埃博拉病毒GP蛋白；

所述药剂用于治疗或预防埃博拉病毒感染。