[发明专利]一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法及其应用

说明书

本发明涉及环境和生物检测技术领域，尤其是涉及一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法及其应用。定量检测方法包括以下步骤：(1)环境样本的采集和预处理；(2)基因组DNA提取；(3)宏基因组测序；(4)新型氯霉素抗性基因的比对和细菌16S rRNA基因数目的统计；(5)新型氯霉素抗性基因的定量分析。相比于现有的技术，本发明简便易行，无需构建标准质粒，不受样品类型的限制，检测时效性较高，且比对结果准确性较高，同时可准确实现对该基因在不同环境样品中的定量分析，大大提高了精准检测的时效性，有利于其在实际环境样品监测中进行推广。

技术领域

本发明涉及环境和生物检测技术领域，尤其是涉及一种用于环境样本中新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法及其应用。

背景技术

近年来，抗生素的广泛使用甚至大量滥用导致环境中的抗生素含量不断升高，俨然已经成为重要的环境问题。环境中抗生素的残留促进了具有抗生素耐受型细菌的增殖以及抗生素抗性基因的传播，严重威胁人类健康。

氯霉素作为一类广谱抗生素，对鼠伤寒杆菌、大肠杆菌以及肺炎球菌等细菌具有良好的抑菌效果，因此在临床有较为广泛的应用。随着研究的不断深入及其广泛的使用，研究人员发现氯霉素的耐药性也在逐年上升，虽然世界上很多国家都已禁止氯霉素在兽医临床和食品动物中的使用，但目前环境中氯霉素残留量问题依然不容忽视。残留在环境中的抗生素会对环境中微生物产生选择压力，从而促进抗生素抗性基因(ARGs)在细菌间的传播并诱导新型ARGs产生。目前现有的新型ARGs检测技术主要是依赖于纯培养技术和分子生物学技术结合的方式，虽然该方式能够实现对新型ARGs的准确定性分析，但该方法验证周期长，操作较为复杂，而且无法实现对环境样品进行高通量检测，因此，需要开发一种简便快速的方法来对不同环境样品中新型氯霉素抗性基因进行快速准确的定量分析。

发明内容

为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法及其应用，该方法操作简单易行，可大幅缩短检测周期，且检测结果准确度较高。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一方面，本发明提供了一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，包括以下步骤：

(1)环境样本的采集和预处理；

(2)基因组DNA提取；

(3)宏基因组测序；

(4)新型氯霉素抗性基因的比对和细菌16S rRNA基因数目的统计；

(5)新型氯霉素抗性基因的定量分析。

进一步地，步骤(1)中所述环境样本包括地表水、反应器活性污泥和自来水。

进一步地，步骤(1)中所述环境样本的预处理为：当环境样本为地表水和自来水时，使用0.22μm滤膜过滤，然后将滤膜放置-80℃保存；

当环境样本为反应器活性污泥时，将反应器活性污泥通过6000-8000rpm，4℃离心10-15分钟，弃上清后收集沉淀，然后将沉淀放置-80℃保存。

进一步地，步骤(3)中所述宏基因组测序采用的平台为IlluminaNovaSeq 6000，测序策略为150PE。

进一步地，步骤(4)中所述新型氯霉素抗性基因的比对为通过采用DIAMOND软件将双端数据与新型氯霉素抗性基因进行比对。

进一步地，所述DIAMOND软件的具体参数设置如下：diamond blastx-d CL5-p 16-q CL0-1_1.fq-f 6-o CL0-1-e 1e-10-k 20--id 95。

进一步地，步骤(4)中所述细菌16S rRNA基因数目的统计为通过采用Metaxa2软件对样本中的16S rRNA基因的数目进行统计。