[发明专利]一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法及其应用

权利要求书

1.一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)环境样本的采集和预处理；

(2)基因组DNA提取；

(3)宏基因组测序；

(4)新型氯霉素抗性基因的比对和细菌16S rRNA基因数目的统计；

(5)新型氯霉素抗性基因的定量分析。

2.根据权利要求1所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述环境样本包括地表水、反应器活性污泥和自来水。

3.根据权利要求2所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述环境样本的预处理为：当环境样本为地表水和自来水时，使用0.22μm滤膜过滤，然后将滤膜放置-80℃保存；

当环境样本为反应器活性污泥时，将反应器活性污泥通过6000-8000rpm，4℃离心10-15分钟，弃上清后收集沉淀，然后将沉淀放置-80℃保存。

4.根据权利要求1所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述宏基因组测序采用的平台为Illumina NovaSeq 6000，测序策略为150PE。

5.根据权利要求4所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述新型氯霉素抗性基因的比对为通过采用DIAMOND软件将双端数据与新型氯霉素抗性基因进行比对。

6.根据权利要求5所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，所述DIAMOND软件的具体参数设置如下：diamond blastx-d CL5-p 16-q CL0-1_1.fq-f6-oCL0-1-e 1e-10-k 20--id 95。

7.根据权利要求4所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述细菌16S rRNA基因数目的统计为通过采用Metaxa2软件对样本中的16S rRNA基因的数目进行统计。

8.根据权利要求7所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，所述Metaxa2软件的具体参数设置如下：metaxa2-1CL0-1_1.fq-2CL0-1_2.fq-o CL0-1。

9.根据权利要求1所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，步骤(5)中所述新型氯霉素抗性基因的定量分析按照下列公式进行计算：

其中，N_{ARG-like sequence}代表双端序列比对到数据库中抗性基因(ARG)的条数，L_reads代表测序数据的长度，L_{ARG reference sequence}代表相应ARG参考基因的长度，N_{16S sequence}代表数据中16SrRNA基因的条数，L_{16S sequence}代表16S rRNA基因的长度，这里取值Greengene数据库中16SrRNA基因的平均长度1432bp，最终Abundance的单位为copy ARG/copy of 16S rRNA gene。

10.权利要求1-9中任一项所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法的应用，其特征在于，用于环境样本中新型氯霉素抗性基因的测定。