[发明专利]基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法

说明书

本发明属于动物模型构建技术领域，公开了一种基因位点定点插入基因条件性过表达模型(Rosa26‑LSL‑IE2)构建方法，通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和gRNA；通过In‑Fusion cloning的方法构建同源重组载体donor vector；将Cas9mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠。本发明IE2转基因鼠的建模成功克服种属特异性，构建了能稳定持续表达ie2的机体环境。

技术领域

本发明属于动物模型构建技术领域，尤其涉及一种基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法。

背景技术

目前，人巨细胞病毒(HCMV)属于疱疹病毒β亚科，为线状双链DNA病毒，在人群中感染率高达100％，具有潜伏活化的生物学特性。正常人感染时表现为无症状的隐性或潜伏感染，而一旦人体免疫机能发生重大变化时如肿瘤、HIV感染、器官移植和新生儿等，HCMV即可从潜伏感染中活化而发生原发性、继发性的增殖感染，引起严重的临床症状甚至死亡。先天性及围产期病毒的感染是出生缺陷的主要病毒原因，主要导致中枢性神经系统先天性畸形。神经干细胞、神经元及神经胶质细胞对HCMV普遍易感，故胚胎期HCMV感染常常导致严重的CNS畸形发生。胎儿在感染HCMV后，仅10％～15％有明显的症状。而90％以上的婴儿出生时可能呈隐性感染，无症状，数年后，逐步出现耳聋、智力迟钝等迟发性神经系统损伤。由于种属特异性，迄今为止对HCMV在机体内长期持续性感染及其与疾病关系的分子机制尚未阐明。因此，亟需一种能够有效阐明HCMV在机体内长期持续性感染及其与疾病关系的分子机制的动物模型。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：由于种属特异性，迄今为止对HCMV在机体内长期持续性感染及其与疾病关系的分子机制尚未阐明。

解决以上问题及缺陷的难度为：由于种属特异性，先前对HCMV感染造成神经系统损伤机制的研究仅限于体外。由于体外环境不能完全模拟机体内环境，所以对先天性HCMV造成神经系统疾病的机制的研究具有局限性。为了更好地阐明先天HCMV感染机体内造成神经系统损伤的分子机制，我们构建了Rosa26定点IE2基因条件性过表达模型,简写为：Rosa26-LSL-IE2。

解决以上问题及缺陷的意义为：该模型的建模成功克服了HCMV种属特异性，构建了能稳定持续表达ie2的机体环境，这将有助于进一步阐明HCMV先天性感染导致神经系统疾病的机制和为疾病的防治提供理论依据。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法。

本发明是这样实现的，一种基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法，所述基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法包括：采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，在Rosa26基因位点定点插入CAG-LSL-IE2-WPRE-pA表达框，建立IE2转基因鼠模型。

进一步，所述Rosa26定点IE2基因条件性过表达模型构建方法包括以下步骤：

步骤一，通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA(为定位酶切位点及准确切割做准备)；

步骤二，通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体donor vector(构建表达载体)；

步骤三，将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠(目的基因的插入)；

步骤四，PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠(转基因阳性鼠获取)。

进一步，步骤一中，所述gRNA的基因序列如SEQ ID NO：1所示。