[发明专利]基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法

权利要求书

1.一种基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法，其特征在于，所述基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法采用CRISPR/Cas9，通过同源重组的方式，在Rosa26基因位点定点插入CAG-LSL-IE2-WPRE-pA表达框，建立IE2转基因鼠模型,简写为：Rosa26-LSL-IE2。

2.如权利要求1所述的基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法，其特征在于，所述Rosa26定点IE2基因条件性过表达模型构建方法包括以下步骤：

步骤一，通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA；

步骤二，通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体donor vector；

步骤三，将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；

步骤四，PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠。

3.如权利要求2所述的基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法，其特征在于，步骤一中，所述gRNA的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

4.如权利要求2所述的基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法，其特征在于，步骤二中，所述同源重组载体donor vector包含3.3kb 5’同源臂、CAG-LSL-IE2-WPRE-pA和3.3kb 3’同源臂。

5.如权利要求2所述的基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法，其特征在于，步骤三中，所述F0代小鼠为嵌合体。

6.如权利要求2所述的基因位点定点插入基因条件性过表达模型构建方法，其特征在于，步骤四中，所述F0代小鼠基因型鉴定，包括：

(1)将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20天后出生获得F0代小鼠；

(2)通过PCR扩增及测序，并进行基因型鉴定。

7.一种由权利要求1～6任意一项所述的Rosa26定点IE2基因条件性过表达模型构建方法构建得到的基因位点定点插入基因条件性过表达模型，其特征在于，所述基因位点定点插入基因条件性过表达模型为UL122转基因鼠模型。

8.一种如权利要求7所述的基因位点定点插入基因条件性过表达模型在HCMV在机体内长期持续性感染检测中的用途。

9.一种如权利要求7所述的基因位点定点插入基因条件性过表达模型在HCMV于疾病关系的分子机制的动物模型中的用途。

10.一种构建持续表达ie2的方法，其特征在于，所述构建持续表达ie2的方法使用权利要求7所述的基因位点定点插入基因条件性过表达模型。