[发明专利]桑花叶型矮缩相关病毒MMDaV侵染性克隆载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种桑花叶型矮缩相关病毒MMDaV侵染性克隆载体及其构建方法和应用。在获得桑花叶型矮缩相关病毒基因组全序列的基础上，将2.0个正向重复的桑花叶型矮缩相关病毒全长基因组构建在植物表达载体pBinPLUS上，通过电击的方法转入农杆菌菌株，获得以农杆菌介导的对植物有侵染能力的病毒载体。采用本发明提供的侵染性克隆载体能在本氏烟上引起坏死反应，操作简单，重复性好；利用本发明提供的侵染性克隆载体可有效用于植物抗病反应分析。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种单链DNA病毒，双生病毒科，桑花叶型矮缩相关病毒(Mulberry mosaic dwarf-associated virus,MMDaV)的侵染性克隆构建。

背景技术

桑花叶型矮缩相关病毒(Mulberry mosaic dwarf-associated virus,MMDaV)是严重影响桑树的生长和桑叶产量的一种单组份双生病毒，该病害发生时，桑树呈现矮化、叶片黄化皱缩、等症状。MMDaV的基因组是大小为2952nt的单链环状DNA分子，病毒链含有5个ORF(V1、V2、V3、V4和V5)：V1可能编码衣壳蛋白，V2编码的蛋白为RNA沉默抑制子，V3、V4和V5的序列与已知的双生病毒序列的同源性很低，其编码的蛋白的功能还不明确；互补链含有2个ORF(C1和C1：C2)，其编码的蛋白可能与病毒的复制有关。MMDaV的病毒链与互补链之间为基因间隔区，含有病毒复制和转录的起始位点。目前，MMDaV的生物学特性和致病机理尚不明确。

植物病毒的侵染性克隆是植物病毒学研究的基础工具。利用突变、重组等分子操作，可在体外对病毒基因组进行修饰和改造；通过分析重组病毒的表型和特性变化，可以研究病毒基因组的结构、明确病毒基因及产物的功能以及理解病毒与宿主的相互作用。此外，病毒的侵染性克隆还可以用于评价植物的抗性，为筛选抗病毒植物以及病毒的防控提供重要手段。

发明内容

本发明的第一个目的是提供MMDaV的侵染性克隆载体及其制备方法。

本发明的第二个目的是提供携带MMDaV侵染性克隆的农杆菌菌株及其应用。

本发明以MMDaV为材料，利用分子生物学的方法将2.0个正向重复的MMDaV全长基因组构建在具有高度复制能力的植物表达载体pBinPLUS上，重组载体通过电击的方法转入农杆菌菌株，获得以农杆菌介导的对植物有侵染能力的病毒载体。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种MMDaV的侵染性克隆载体，将2.0个正向重复的MMDaV全长基因组构建在具有高度复制能力的植物表达载体pBinPLUS制备得到，所述的MMDaV全序列如SEQ ID NO：6所示。

该MMDaV的侵染性克隆载体的制备方法，包括以下的步骤：

(1)植物总DNA的提取：采用CTAB方法从采集的感染MMDaV的桑树中提取植物基因组总DNA；

(2)MMDaV全长序列的克隆和测序：利用PCR扩增体系，以含有MMDaV病毒的桑树DNA为模板，以MMDaV FL/SalI-F和MMDaV FL/KpnI-R(插入SalI和KpnI位点)为引物进行PCR扩增，PCR产物插入到pEasy-T1载体上，筛选得到pEasy T1-MMDaV-PL(含有SalI和KpnI特异性酶切位点)。以MMDaV FL/KpnI-F和MMDaV FL/KpnI-R(插入KpnI位点)为引物扩增目的片段(2952bp)，同样将PCR产物插入到pEasy-T1载体上，筛选得到pEasy T1-MMDaV-FL(含有KpnI特异性酶切位点)；

所述的引物MMDaV FL/SalI-F、MMDaV FL/KpnI-F和MMDaV FL/KpnI-R的基因序列分别为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3；