[发明专利]桑花叶型矮缩相关病毒MMDaV侵染性克隆载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种桑花叶型矮缩相关病毒MMDaV的侵染性克隆载体，其特征在于：将两个拷贝的MMDaV全长序列融合到pBinPLUS载体制备得到，所述MMDaV全序列如SEQ ID No:6所示。

2.根据权利要求1所述的桑花叶型矮缩相关病毒MMDaV的侵染性克隆载体的制备方法，其特征在于，包括以下的步骤：

(1)植物总DNA的提取：采用CTAB方法从采集的感染MMDaV的桑树中提取植物基因组总DNA；

(2)MMDaV全长序列的克隆和测序：利用PCR扩增体系，以含有MMDaV病毒的桑树DNA为模板，以MMDaV FL/SalI-F和MMDaV FL/KpnI-R为引物进行PCR扩增，PCR产物插入到pEasy-T1载体上，筛选得到pEasy T1-MMDaV-PL；

以MMDaV FL/KpnI-F和MMDaV FL/KpnI-R为引物扩增目的片段，将PCR产物插入到pEasy-T1载体上，筛选得到pEasy T1-MMDaV-FL；

所述引物MMDaV FL/SalI-F、MMDaV FL/KpnI-F和MMDaV FL/KpnI-R的基因序列分别为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3；

(3)pBinPLUS-MMDaV-PL的克隆：将测序正确的T1-MMDaV-PL质粒用SalI和KpnI限制性酶进行酶切，回收目的片段；同时再将植物双元表达载体pBinPLUS用SalI和KpnI限制性酶进行酶切回收纯化后，利用T4 DNA连接酶，将SalI和KpnI限制性酶酶切后的MMDaV片段与pBinPLUS连接得到pBinPLUS-MMDaV-PL；

(4)pBin-MMDaV 2A的克隆：将测序正确的T1-MMDaV-FL质粒用KpnI限制性酶酶切，回收目的片段；同时用KpnI限制性酶酶切pBinPLUS-MMDaV-PL质粒，回收纯化后，利用T4 DNA连接酶，将同样用KpnI限制性酶酶切回收的MMDaV片段与pBinPLUS-MMDaV-PL片段连接，筛选得到含有2个串联重复的pBin-MMDaV 2A质粒。

3.权利要求1所述的侵染性克隆载体在MMDaV的致病性分析、病毒基因功能研究中的应用。

4.一种携带MMDaV侵染性克隆的农杆菌菌株，其特征在于：通过电击转化方法将权利要求1所述的侵染性克隆载体转入到EHA105农杆菌感受态细胞中，即可得到含有MMDaV侵染性克隆的农杆菌。

5.权利要求4所述农杆菌菌株在MMDaV的致病性分析、病毒基因功能研究中的应用。