[发明专利]一种哌尼生素前体、表达盒及其制备方法

说明书

本发明提供了一种哌尼生素前体、表达盒用于高效表达哌尼生素，所述前体为蛋白簇包括核心肽penA1、penB蛋白、penT蛋白、penC蛋白和penD蛋白，并提供了用于编码上述哌尼生素前体的表达盒，从5’端到3’端核心肽编码基因penA1、penB蛋白编码基因penB、penT蛋白编码基因penT、penC蛋白编码基因penC、penD蛋白编码基因penD依次串联排列。本发明获得的哌尼生素，活性好，生物稳定性强，对热、胃液肠液等具有很好的耐受性，抑菌效果显著，而且表达量高，培养成本低、生产周期短、易于产业化。

技术领域

本发明涉及一种哌尼生素及其制备方法，属于生物技术领域。

技术背景

细菌素是细菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，有着理想的益生菌特性，其具备有效抑制病原体、调节炎症、促进伤口愈合和粘膜防御等功能，且不产生任何副作用的特点。哌尼生素(Penisin)由Paenibacillus sp A3产生，属于翻译后修饰多肽lantibiotics，由44个氨基酸残基组成(序列为：NFGLYTSQCYSSQCYSSKCYSDSCYSSDCYTGRHMCGYTHGYSC)，分子量4594.5Da，pH2-12稳定、耐受胰蛋白酶和蛋白酶K，对大肠杆菌、恶臭假单胞菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌的MIC小于10μg/ml，浓度为92μg/ml时溶血性同PBS相当、对哺乳动物细胞无毒性，80mg/kg体重用量时能显著降低小鼠大腿感染模型(金黄色葡萄球菌MTCC96)的细菌载量(Baindara等，2016)，具有开发成饲用抗生素替代品的潜力。

哌尼生素通常由野生型Paenibacillus sp A3分泌，但是哌尼生素受到培养方式、培养基成分的影响，其分泌量很少，而且培养成本高。目前尚未有优化或者人工改造哌尼生素的生产菌株。

因此本专利利用枯草芽孢杆菌SCK168为表达宿主菌，将哌尼生素的基因簇基因penA1BTCD构建成表达盒，成功实现哌尼生素在枯草芽孢杆菌高效分泌表达，提高哌尼生素的产量，降低生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种哌尼生素(penisin)高效表达的前体、表达盒、方法用于生产和制备哌尼生素，为饲料添加剂、兽药、食品及医药提供一种廉价的生物抗菌剂和防腐剂。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种哌尼生素前体，包括核心肽penA1、penB蛋白、penT蛋白、penC蛋白和penD蛋白。

优选的，上述分泌型哌尼生素前体中核心肽penA1氨基酸序列为SEQ ID NO.2。SEQID NO.2为核心肽或者不成熟肽，经过前体中其他功能蛋白加工修饰后切除N端20个氨基酸，形成只有44个氨基酸的成熟肽。

一种哌尼生素的表达盒，用于编码上述哌尼生素前体。具体的，从5’端到3’端核心肽编码基因penA1、penB蛋白编码基因penB、penT蛋白编码基因penT、penC蛋白编码基因penC、penD蛋白编码基因penD以依次串联排列。

上述哌尼生素的表达盒，包括启动子，启动子的3’端连接核心肽编码基因penA1。

上述分泌型哌尼生素的表达盒，核心肽penA1编码基因、penB蛋白编码基因、penT蛋白编码基因、penC蛋白编码基因、penD蛋白编码基因的串联位置有核糖体结合位点。

上述分泌型哌尼生素的表达盒，所述启动子为P43启动子。

上述哌尼生素的表达盒，采用三段克隆片段，片段1为penA1编码基因，片段2为penB蛋白编码基因和penT蛋白编码基因，片段3为penC蛋白编码基因和penD蛋白编码基因。