[发明专利]一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法

说明书

利用蛋白质工程原理和方法，在蛋白质相互作用分析以及药理学实验基础上，本专利制备了具有较高抗凝血活性的菲牛蛭基因突变水蛭素HM2‑E60D‑I62D。以HM2‑E60D‑I62D为模板，在分析血液蛋白酶的酶切位点以及人工定向进化随机突变基础上，制备血浆代谢速度较缓慢的HM2‑E60D‑I62D突变蛋白：HM2‑E60D‑I62D‑K26H、HM2‑E60D‑I62D‑L30I、HM2‑E60D‑I62D‑K47H、HM2‑E60D‑I62D‑S48T、HM2‑E60D‑I62D‑K26H‑L30I‑K47H‑S48T和HM2‑E60D‑I62D‑T43S。本发明专利说明书详细介绍了以上菲牛蛭基因突变水蛭素以及它们的制备方法和药理学作用。

技术领域

本发明属于蛋白质工程制药领域，具体涉及一组一级结构经过改造的基因重组菲牛蛭水蛭素，及其制备和分离纯化方法。

背景技术

菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)水蛭素(HM2)是水蛭素(Hirudin)的一种，是由吸血水蛭菲牛蛭的唾液腺分泌的具有抗凝血活性的多肽类物质。HM2是由64个氨基酸组成的单一多肽链，相对分子质量为6.8kD。在凝血途经中，水蛭素以凝血级联反应中的核心酶——凝血酶(Thrombin)作为靶标,与α-凝血酶按化学计量1:1的形式形成稳定的非共价复合物，从而阻断凝血酶催化纤维蛋白原形成不溶性纤维蛋白的能力。水蛭素—凝血酶复合物的晶体结构分析表明，水蛭素的球形N-末端结构与凝血酶的疏水性活性中心结合，富含酸性氨基酸的C-末端尾巴与凝血酶的“外部位点I”(ExositeⅠ)结合。“外部位点I”是凝血酶与纤维蛋白原的结合部位。水蛭素与凝血酶的结合方式为两相动态结合，C末端封闭凝血酶“外部位点I”，使凝血酶的构型发生细微变化，并促进N末端与凝血酶的活性中心结合，从而抑制凝血酶的催化活性。多种动物模型和临床药理研究表明，水蛭素能够有效地预防和治疗血栓性疾病，特别是对于凝血酶在发病机制中起关键作用的疾病。

水蛭素主要从吸血水蛭的唾液中提取，近年来，也有研究者利用微生物表达基因重组水蛭素，但微生物表达水蛭素的C末端氨基酸残基不发生硫酸化，缺少与“外部位点I”相互作用的带有负电荷的基团，因此抗凝血活性低于野生型水蛭素。为了解决这一问题，我们利用基因工程技术将C末端的多个氨基酸残基突变为天冬氨基酸，以增加水蛭素C末端所带的负电荷，获得较高抗凝血活性的基因重组菲牛蛭水蛭素。在此突变型菲牛蛭水蛭素基础上，进一步构建表达多种基因突变水蛭素，以延缓HM2血浆代谢速度，本专利包括已经过筛选的活性强于野生型菲牛蛭水蛭素并且血液稳定性较高的菲牛蛭水蛭素突变体。

发明内容

1.发明的目的

利用大肠杆菌工程菌种表达并纯化出一组基因重组氨基酸突变蛋白，具有较强抗凝血活性并且血浆代谢较慢的菲牛蛭水蛭素突变体，及其制备方法。

2.发明的技术方案

一、用于提高抗凝血活性的重组菲牛蛭水蛭素HM2突变体的设计

氨基酸序列比对：从Uniprot中获取菲牛蛭水蛭素(HM2，核苷酸或氨基酸序列表中第1条序列)和日本医蛭水蛭素(HV1)的氨基酸序列，利用ClustalX2软件对HM2和HV1的氨基酸进行序列比对，HM2的C末端的关键氨基酸为第61位氨基酸为天冬氨酸(图1)。

突变体的设计：我们设计了多种用于提高水蛭素抗凝血活性的突变体，并进行筛选，本专利设计所描述的是经过筛选的HM2的突变体HM2-D61A,HM2-E60D-I62D。

二、用于提高抗凝血活性的重组水蛭素HM2及其突变体的表达质粒构建

模板的准备：从NCBI获得HM2的CDS序列。根据原核表达系统中密码子的偏好性，进行碱基序列优化(核苷酸或氨基酸序列表中第2条序列)，并合成。

序列的准备：设计PCR引物，利用上游引物引入His亲和纯化标签，利用下游引物序列引入氨基酸突变位点的碱基序列。