[发明专利]一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法

说明书

一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法，直接从产孢菌落上拾取孢子并转移分散到观测平板上，按如下步骤操作：1)材料及器具的准备；2)孢子源的准备；3)孢子观测板的制备；4)孢子的拾取与密集孢子的稀释；5)孢子的转移与释放；6)孢子的培养观测。本发明具有如下优点：1)不需要将关键的工作材料(薄壁分生孢子)配备成孢子悬浮液，减少污染风险；2)可以在长条状的培养平板上散布与观测薄壁分生孢子的萌发与生长，提高观测孢子萌发活动的效率与效果，有利于开展孢子萌发生物学研究中的多因素作用设计与批量测试比较。

技术领域

本发明涉及植物病理学技术，具体是一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法。

背景技术

稻曲病是我国水稻生产的一种重要病害，可给水稻生产造成重大损失，该病害由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)侵染引起。薄壁分生孢子是稻曲病菌的无性繁殖体，在稻曲病的病害循环和病害流行中发挥重要作用。充分认识薄壁分生孢子的萌发生物学对有效防控稻曲病的发生流行至关重要。在稻曲病菌繁殖体的萌发生物学及相关的研究工作中，经常需要将薄壁分生孢子移植/转移到培养平板上进行观测培养，这种观测培养不仅要求培养平板上的孢子处于恰当的分散状态，也要求各个移植处理平板上的孢子数量及分布保持一致。只有这样才能高质量完成有关的研究测试。

当前将薄壁分生孢子转移及分散到培养平板的方法，几乎都是水液载体移植方法，该方法的技术要点是，将产孢制备培养获得的孢子悬浮到水液载体中，配备成孢子悬浮液(简称孢子液)，然后用移液器将孢子液定量转移到培养基观测平板面上，并用工具将孢子液涂布分散到平板上，再进行有关的培养与观察等测试工作。该方法看似简单，但实践操作上仍存在相当的难度与繁琐，主要表现在，关键的工作材料(薄壁分生孢子)的获得技术操作中，往往需要采取过滤操作以脱减孢子液中的菌丝，也需要离心沉淀操作脱除孢子液中的培养基以及培养代谢产物等，这些操作过程存在较大的污染风险，另外，需要将孢子液的孢子浓度调整到合适的范围，因此需要反复的调配与取样到计数板或载玻片，还要转到生物显微镜下观察计数，比较繁琐。

发明内容

本发明的目的是，提供一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法，直接从产孢菌落上拾取孢子并转移分散到观测平板上，孢子转移和分散的操作步骤如下：

1.材料及器具的准备

用常规方法制备马铃薯琼脂培养基作孢子萌发观测培养基备用；用培养皿作保湿容器，常规消毒后备用；用棉签作孢子转移器具，先在棉签上用记号笔点画标记，再装入枪头盒，进行高温高压灭菌后备用。

2.孢子源的准备

采用马铃薯琼脂培养基作为稻曲病菌薄壁分生孢子的产孢培养基，进行稻曲病菌的产孢培养，直至形成产孢菌落，以该产孢菌落作为孢子源菌落。

3.孢子观测板的制备

取步骤1制备的马铃薯琼脂培养基加热熔化，倒入灭菌培养皿制成普通平板，平板冷凝后用灭菌刀片将该平板切成条状平板，并将条状平板转移到灭菌载玻片上，作为分生孢子观测板。

4.孢子的拾取与密集孢子的稀释

将步骤1准备的灭菌棉签的端部球面，在步骤2准备的孢子源菌落上碰触，吸附拾取孢子；然后转移到空白琼脂平板上抹涂与点印，稀释棉签上的密集孢子；在进入下一步骤操作前，将已经拾取孢子的棉签置于步骤1准备的保湿容器内，以保护棉签吸附孢子的活性。

5.孢子的转移与释放

取步骤4稀释孢子后的棉签，在步骤3制备的孢子观测板面不同位置作有序连续点印，得到孢子数量相近、且孢子分散性良好的孢子印迹。

6.孢子的培养观测