[发明专利]一种烟草提取物残渣的二次提取方法

权利要求书

1.一种烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)：将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(MicrococcaceaePribram)ZY02的菌落接种至液体培养基中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，制得种子液；

步骤(2)：将种子液在4000r/min，4℃的条件下低温离心20min，去除上清液，加入无菌水复溶，调节OD₆₀₀为2.0，制得微球菌种子；

步骤(3)：将烟草提取物残渣与去离子水按照质量比1:(1-10)混合，得到残渣混溶物；

步骤(4)：将微球菌种子和残渣混溶物按照体积质量比1:(10-200)混合，恒温搅拌发酵12-96h，得到发酵残渣混溶物，其中，微球菌种子的体积的单位为mL，残渣混溶物的质量的单位为g；

步骤(5)：过滤发酵残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物，对第一滤液离心进行离心处理，得到上清液和第二固形物；

步骤(6)：将第一固形物和第二固形物混合得到第三固形物，将第三固形物和无水乙醇按照质量体积比1:(1-20)混合，常温震荡一段时间后，过滤得到第二滤液，其中，第三固形物的质量的单位为g，无水乙醇的体积的单位为mL；

步骤(7)：将上清液和第二滤液混合，得到烟草二次提取液；

步骤(8)：将烟草二次提取液真空浓缩至密度为1.195-1.205g/mL，得到浓缩液；

步骤(9)：浓缩液采用回流提取装置在110℃条件下加热烘烤1-5h，得到烘烤浓缩液；

步骤(10)：在烘烤浓缩液中加入无水乙醇，低温静置一段时间后，离心取上清液，得到醇沉物；

步骤(11)：在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的1％-50％的1,2-丙二醇，即得到烟草二次提取物。

2.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中的液体培养基为LB液体培养基。

3.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养的条件如下：

温度为30℃，震荡速度为150r/min，时间为12h。

4.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(4)具体如下：

将微球菌种子和残渣混溶物按照体积质量比1:(10-200)混合，在30℃下恒温搅拌发酵12-96h，搅拌转速为180r/min，得到发酵残渣混溶物，其中，微球菌种子的体积的单位为mL，残渣混溶物的质量的单位为g。

5.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(5)具体如下：

步骤(5-1)：过滤发酵残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物；

步骤(5-2)：在4℃下以8000r/min的速率离心第一滤液20min，得到上清液和第二固形物。

6.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(6)具体如下：

将第一固形物和第二固形物混合得到第三固形物，将第三固形物和无水乙醇按照质量体积比1:(1-20)混合，常温下150r/min震荡2h后，用快速滤纸过滤，得到第二滤液，其中，第三固形物的质量的单位为g，无水乙醇的体积的单位为mL。

7.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(8)具体如下：

将烟草二次提取液在温度50℃、真空度为150mbar的条件下浓缩至密度为1.195-1.205g/mL，得到浓缩液。

8.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(10)具体如下：

烘烤浓缩液中加入其3倍体积的无水乙醇，-20℃下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。

9.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(11)具体如下：

在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的10％的1,2-丙二醇，即得到烟草二次提取物。