[发明专利]一种DNA编码化合物库药物分子垂钓方法

说明书

本发明将金属纳米粒子探针与靶蛋白或靶蛋白结合受体蛋白偶联，加入事先制备好的DNA编码化合物库中孵育进行分子垂钓，通过PCR扩增与DNA测序获得靶向药物信息。然后，分别制备金属纳米粒子探针和磁珠探针并与拉曼信号分子耦联，再将金属纳米粒子探针或磁珠探针分别与靶蛋白或靶蛋白结合受体蛋白耦联，加入到筛选获得的靶向药物中检测拉曼信号，判断所述待筛选化合物是否为靶向抑制剂，通过对PCR扩增及DNA测序获得筛选化合物的结构。本发明首次将分子垂钓与DNA编码化合物库相结合，在蛋白互作水平上进行药物筛选，并结合表面增强的拉曼散射光谱，形成简单灵敏的新药筛选方法。

技术领域

本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种DNA编码化合物库药物分子垂钓方法。

背景技术

分子垂钓(Molecule Fishing)是一种基于药物靶点与活性分子的相互作用，从复杂的生物样品中亲和选择配体，以实现先导化合物的发现的高通量生物分析方法，具有特异性强、效率高、对样品预处理要求少等特点，是传统高通量筛选方法(High ThroughputScreening, HTS)基础上的重要技术进步。一般由靶标固定化(酶、细胞等)、亲和垂钓、配体洗脱与LC-MS分析4个部分组成。分子垂钓技术包括离线模式的分子垂钓技术和在线模式的分子垂钓技术。在离线模式的分子垂钓中，亲和垂钓和配体结构分析是独立进行的，分子垂钓对设备和技术的要求相对较低，因此广泛应用于实验室的配体筛选实验，包括亲和超滤法、磁性纳米粒子垂钓法、中空纤维分离法。而在在线模式的分子垂钓技术中，亲和分离和配体结构分析是同时进行的，与离线模式相比具有高自动化程度、高简便性、高灵敏性的特点。同时，亲和分离和配体结构分析的同步进行可以实现在线动态监测，获取组分与靶标的相互作用动力学参数，有助于探究和改进实验机制，包括生物亲和色谱法、毛细管电泳法、BIA技术。

其中，基于表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR) 的生物分子相互分析(Biomolecular Interaction Analysis,BIA)技术是一种新型生物传感技术。由此技术开发出的生物传感仪器商品名为 Biacore，主要包括SPR光学检测系统、微射流卡盘、传感器芯片3 个核心部分。分析时，将一种生物分子耦联在传感芯片表面，再将另一种与之发生相互作用的生物分子溶液注入SPR光学检测系统中，流经传感芯片表面与耦联在传感芯片上的生物分子相结合，芯片表面物质质量增加，折射率发生变化，通过SPR响应值可实时监测生物分子间的相互作用变化。Biacore不需要使用荧光标记和同位素标记，直接通过表面等离子共振的物理光学现象，测量其光学反射率的变化，实时追踪生物分子间相互作用的方法，具有极高的灵敏度、分辨率和特异性。然而，Biacore技术对样品要求高，对样品量耗费巨大，具有明显的局限性。

在当代新药开发领域，针对生物靶点建立大规模的候选药物分子库进行高通量筛选是新药研发中获得先导化合物不可或缺的手段之一，当今世界上大型制药公司均具有自己大规模的分子库和筛选平台。然而，基于单分子的高通量筛选所需成本高，实验设备昂贵，管理运行复杂，时间跨度大，合成的化合物有限且单一，极大地限制了先导化合物的发现效率。近年来，随着高通量技术的不断发展，DNA编码化合物库(DNA Encoding ChemicalLibrary,DEL)技术逐渐成为药物研发领域的新兴筛选方法。DEL筛选的原理是将一段特异性DNA序列与一个小分子化合物在分子水平上连接，DNA序列作为小分子的标记序列，使每一个反应中的小分子对应独一无二的DNA片段。通过对目标化合物连接的独特DNAbarcodes进行PCR扩增与测序，挑选出所需小分子化合物的结构信息。它可以实现在极小的体系中完成千亿级别高通量的筛选，极大地提高了先导化合物的发现效率，是新药研发的重要手段之一。然而，传统的DEL只对单一蛋白靶点发生作用，不能在蛋白互作水平上发挥作用。随着人们对癌症靶向抑制的研究，只针对单一靶点的药物筛选显然不能满足蛋白互作机制的需要。