[发明专利]非受体酪氨酸激酶TNK2蛋白在防治流感病毒感染中的应用

权利要求书

1.一种建立抗流感病毒感染的细胞系的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统敲除细胞中的TNK2基因，所述CRISPR/Cas9系统使用靶向TNK2 基因的双gRNA序列，靶向TNK2 基因的双gRNA序列，包括TNK2-gRNA1和TNK2-gRNA2，

所述TNK2-gRNA1的靶向序列为: TGGCAGGAATAGGGGACGT，

所述TNK2-gRNA2的靶向序列为: CTCATCATTCTGACTACCG。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述TNK2-gRNA1的核苷酸序列包括:

TNK2-gRNA1 Oligo1: 5'-CACCGTGGCAGGAATAGGGGACGTGT-3'

TNK2-gRNA1 Oligo2: 5'-TAAAACACGTCCCCTATTCCTGCCAC-3'

所述 TNK2-gRNA2的核苷酸序列包括:

TNK2-gRNA2 Oligo1: 5'-CACCGCTCATCATTCTGACTACCGGT-3'

TNK2-gRNA2 Oligo2: 5'-TAAAACCGGTAGTCAGAATGATGAGC-3'。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

设计 2对sgRNA寡核苷酸链，然后将Oligo1和Oligo2混合到10 mM Tris-HCl (pH8.0)和 5 mM MgCl2的缓冲液中，在95°C 孵育5分钟，然后冰上冷却，形成双链；双链gRNAs再分别克隆至酶切后的gRNA克隆载体pKLV-flipedU6gRNA_CCDB_PB_BbsI_PGKpuro2ABFP中，并转化大肠杆菌TOP10, 挑单克隆菌株，提取质粒；

将提前构建后的稳转Cas9的A549细胞Cas9-A549复苏，在转染前将Cas9-A549细胞接种到12孔板，然后将构建好的重组质粒TNK2-gRNA1和TNK2-gRNA2，各1μg与Lipofectamine3000，4μl加至50μl的Opti-MEM中，静止5min后将两者混合，将四种脂质体-质粒DNA混合物静置15min后直接加至细胞培养基中，将细胞重新置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，然后用含有嘌呤霉素的培养基继续培养细胞7-14天，获得阳性单克隆细胞；

提取基因组DNA，利用PCR技术和Sanger测序鉴定是否敲除TNK2基因。

4.一种制备防治流感病毒感染的药物的方法，其特征在于，该药物能够抑制或阻碍非受体酪氨酸激酶TNK2蛋白表达的试剂，所述的药物是指能够抑制或阻碍非受体酪氨酸激酶TNK2蛋白表达的试剂是非受体酪氨酸激酶TNK2蛋白的gRNA或包含gRNA的重组载体。

5.根据权利要求4所述的一种制备防治流感病毒感染的药物的方法，其特征在于，所述的药物是抑制或阻碍非受体酪氨酸激酶TNK2的TNK2-gRNA1和TNK2-gRNA2：

所述TNK2-gRNA1的靶向序列为: TGGCAGGAATAGGGGACGT 、

所述TNK2-gRNA2的靶向序列为: CTCATCATTCTGACTACCG。

6.非受体酪氨酸激酶TNK2蛋白在制备预防或治疗流感病毒感染药物中的应用。