[发明专利]一种牛Ⅰ型胶原蛋白的纯化方法

说明书

本发明涉及一种牛Ⅰ型胶原蛋白的纯化方法，包括以下步骤：将经粗提取处理的牛Ⅰ型胶原蛋白溶解于酸溶液中，使用非胶原蛋白酶的蛋白水解酶进行降解，监测粘度控制酶解程度；将上清液pH调节至3.5‑5，依次滴加终浓度为15‑25％v/v、30‑45％v/v、50‑70％v/v和75‑95％v/v的醇溶液，析出4个去端肽牛Ⅰ型胶原蛋白，离心，酸溶液中复溶，调节至等电点，离心取沉淀，再次在酸溶液中复溶，并在pH为3‑5的酸溶液中透析，过滤除菌，取滤液冻干，得到纯化后的牛Ⅰ型胶原蛋白。本发明提供的牛Ⅰ型胶原蛋白纯度高、无免疫原性且为无菌的活性形式，可应用于医用及组织工程材料领域。

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化领域，尤其是一种牛Ⅰ型胶原蛋白的纯化方法。

背景技术

胶原是很多脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质，占总蛋白质量的25％-33％，广泛存在于动物的皮肤、肌腱和骨骼中，其提取制品已广泛应用于医药、保健、食品加工、化妆品等众多领域。到目前为止，已经发现胶原类型29种，研究较多的是Ⅰ-Ⅴ型胶原，其中Ⅰ型胶原是骨、皮肤、肌腱以及其它纤维结缔组织的优势蛋白，占生物体胶原总量的90％。Ⅰ型胶原是纤维形成胶原，能活化上皮细胞，促进生皮细胞增生，也可促进胶原酶生成，使皮肤有张力和弹力，在医药领域用于修复皮肤创伤和骨结构损伤。

Ⅰ型胶原分子的N端和C端具有称为端肽的非螺旋结构域，该端肽决定胶原的抗原性，降低了生物相容性。现有技术中，蛋白提取纯化前期通常会进行粗提取，再通过沉淀、离心等纯化胶原蛋白，但该方法很难获得高纯度的Ⅰ型胶原。

专利CN1304416A公开了一种液体介质中天然胶原蛋白的制备方法，在具有双层横向切刀的混合物中搅拌，剪切胶原蛋白提取物，而后对其进行灭菌，获得无菌的胶原蛋白。但是，冗杂的机械剪切虽然减小了胶原蛋白的尺寸，但同时会导致胶原蛋白螺旋结构不完整；专利CN106946988A公开了一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法分离纯化I型胶原蛋白；刘丽莉等(牛骨Ⅰ型胶原蛋白提取及结构表征，食品科学，2010，31(02):87-91)采用乙醚低温回流脱脂，0.48％盐酸脱钙，骨粒径为5mm×10mm，以1％柠檬酸和1％胃蛋白酶复合为提取介质提取牛Ⅰ型胶原蛋白；刘雯恩等(优化Ⅰ型胶原蛋白的纯化工艺，精细化工，2019，36(05):850-855+874)采用0.5mol/L乙酸和胃蛋白酶提取Ⅰ型胶原蛋白后,结合等电点沉淀法和超滤纯化技术对Ⅰ型胶原蛋白进行纯化。但均存在提取量小或纯化程度较低的问题。因此，仍需一种提取效率高、纯度高的牛I型胶原蛋白纯化方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种牛Ⅰ型胶原蛋白的纯化方法，本发明的牛Ⅰ型胶原蛋白纯度高、无免疫原性且为无菌的活性形式。

本发明的一种牛Ⅰ型胶原蛋白纯化方法，包括以下步骤：

(1)将粗提取的牛Ⅰ型胶原蛋白溶解，与非胶原蛋白酶的蛋白水解酶混合搅拌，监测粘度变化，酶解完成后离心，取上清液，其中，反应液粘度达到0.01-1Pa·S表示酶解完成；

(2)将步骤(1)的上清液pH调节至3.5-5，依次滴加终浓度为15-25％v/v、30-45％v/v、50-70％v/v和75-95％v/v的醇溶液，依次析出4个胶原蛋白沉淀，SDS-PAGE分析去端肽程度，合并后得到去端肽牛Ⅰ型胶原蛋白沉淀；

(3)将步骤(2)的去端肽牛Ⅰ型胶原蛋白沉淀在pH2-4的酸溶液中复溶，调节至等电点，离心取沉淀，再次在pH2-4的酸溶液中复溶，在pH3-5的酸溶液中透析，过滤除菌，取滤液，得到纯化后的牛Ⅰ型胶原蛋白，其中，透析袋的截留分子量为8-100kDa。

进一步地，在步骤(1)中，非胶原蛋白酶的蛋白水解酶与牛Ⅰ型胶原蛋白的质量比为0.1-10:1。