[发明专利]一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用，所述表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V202148。本发明由II型单纯疱疹病毒蛋白优势表位整合入流感病毒基因组NS片段中组成的重组流感病毒，首次以流感病毒为载体表达II型单纯疱疹病毒蛋白；本发明的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒可以在宿主细胞或鸡胚中稳定传代，可以用于II型单纯疱疹病毒疫苗的开发、相关药物的开发以及利用细胞或鸡胚作为生物反应器生产II型单纯疱疹病毒蛋白。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用。

背景技术

A型流感病毒(influenza A virus)属正粘病毒科，是一类负义，单链的RNA病毒。此类病毒由于血凝素HA和神经氨酸酶NA的重组与变异，可形成多种不同致病性且感染哺乳动物的流感病毒。其颗粒直径为80-120纳米，一般为丝状或球状，由八个编码片段编码而成，共由10种蛋白和8个vRNA基因组组成。8个vRNA分别为：PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M，NS，10种蛋白分别为：PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M1，M2，NS1，NEP。其中三种聚合酶蛋白(PB2，PB1，PA)可与核蛋白(NP)形成核糖核蛋白聚合物(RNPs)，在病进入细胞后释放并转移至细胞核启动基因组的复制与转录。血凝素HA是介导病毒与靶细胞受体结合，促进膜融合以及基因组进入靶细胞的蛋白。神经氨酸酶NA参与子代病毒的释放。M蛋白可通过来自同一RNA区段的不同阅读框来编码两个基质蛋白(M1和M2)，同样的，NS蛋白也通过可变性剪接产生NS1和NEP两个蛋白。病毒RNA的合成发生于细胞核中，而蛋白质的合成则发生于细胞质中，一旦病毒基因组和蛋白组装成子代病毒，病毒就会离开细胞核并向细胞膜迁移。而病毒跨膜蛋白(HA，NA和M2)以及M1蛋白部分可促进子代病毒以出芽方式释放。

反向遗传学技术主要是指某些病毒可通过质粒共转染的方式，产生病毒RNA及蛋白，从而包装出带有感染性和免疫原性的病毒。经过改进，这种方法同样适用于流感病毒此类负义RNA病毒。反向遗传学技术主要包括12质粒系统和8质粒系统，后者是在前者的基础上采用双向启动子手段加以改进的。将编码流感病毒的基因片段插入至PHW2000中，这是个双向表达系统，正向由polⅡ启动子(人巨细胞瘤病毒CMV启动子)开始，中间为插入的病毒基因，直至终止序列(牛生长激素poly(A)信号BGH)，此方向合成病毒mRNA，进一步翻译成病毒蛋白；反向由人polⅠ启动子开始，中间同样为病毒基因，直至鼠polⅠ终止序列，此方向合成病毒vRNA。

2A短肽是一类长18-22个氨基酸残基的肽片段，能诱导细胞内含有2A肽的重组蛋白进行自我剪切。目前比较常用的是四种2A肽：T2A，P2A，E2A，F2A。2A肽会在甘氨酸(G)和脯氨酸(P)连接处造成“剪切”的效果，核糖体无法将前后片段连接起来。2A肽诱导的剪切效率较高，部分情况下剪切效率接近100％。在表达蛋白中，如果要将两段蛋白分开表达，且构建在同一个载体上，就可使用2A短肽连接，翻译出来的蛋白可以有效分开，独立进行折叠，而且能恢复两个蛋白的功能。

II型单纯疱疹病毒(HSV-2)是一类DNA包膜病毒，主要引起生殖器或肛门等下体粘膜疱疹的病毒。大部分生殖器疱疹是由II型单纯疱疹病毒引起的，此外，HSV-2也可引起口腔等上半身部位粘膜溃疡。HSV-2主要的传播方式是性传播，此外母亲也可在怀孕或分娩期间传播给婴儿。由于部分人群初次感染HSV-2后呈无症状或亚临床状态，所以HSV-2在世界范围内得以流行。而另一个助长HSV-2肆虐的原因即是目前尚未针对HSV-2的疫苗，也没有能完全治愈由HSV-2感染所导致的生殖器溃疡的药物。目前世界范围内常用的抗HSV-2的药物是阿昔洛韦，但由于HSV-2能够潜伏至神经节内，阿昔洛韦也只是能抑制病毒复制而已，并不能完全杀死病毒，治愈患者。等到患者免疫力下降时，潜伏中的HSV-2会再次感染粘膜并造成溃疡。正因为如此，HSV-2感染引起的疱疹已经成为医药界的难题，研制对抗HSV-2的疫苗势在必行。

发明内容