[发明专利]一种酿酒酵母蛋白酶缺失菌株的构建及其应用

说明书

本发明提供了一种酿酒酵母蛋白酶缺失菌株的构建及其应用。具体地，本发明提供了基因组中整合有表达外源蛋白的表达盒并且内源蛋白酶基因被敲除的重组酵母菌株，其中，所述的蛋白酶包括：Pep4、Yap3、Prb1和CYM1。本发明的重组酵母菌株可以高效分泌表达外源蛋白，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种酿酒酵母蛋白酶缺失菌株的构建及其应用。

背景技术

人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种在治疗2型糖尿病中具有药用潜力的肠促胰岛素激素。GLP-1的多方面生理作用包括刺激胰岛素表达、抑制胰高血糖素分泌和减少胃排空，有助于葡萄糖水平的正常化。随着2型糖尿病在世界范围内的流行率增加，开发了许多GLP-1衍生物以增强GLP-1的生物活性和药物稳定性。其日益增长的需求要求开发利用重组微生物进行GLP-1及其类似物大规模生产的生物工艺。

由于GLP-1是一种低分子量的多肽激素，当在大肠杆菌中直接表达时，容易被细胞内蛋白水解酶快速降解，融合表达工艺较繁琐，严重影响处理效率。酿酒酵母是一种生物安全菌株，遗传操作简单、基因表达调控机理清楚且高密度发酵技术成熟，许多已上市蛋白或多肽药物以酿酒酵母为宿主进行生产，如：应用于人体的第一个基因工程疫苗-乙型肝炎疫苗就是通过酵母系统生产的，诺和诺德公司的利拉鲁肽前体多肽为酿酒酵母表达。近年来一系列适用于酿酒酵母途径组装工具的开发，使得酿酒酵母成为理想的底盘生物。

酿酒酵母中异源蛋白尤其是GLP-1类多肽的表达水平高度依赖于发酵过程中的蛋白酶。但是，酿酒酵母中包含多种不同类型的蛋白酶，功能和作用方式多样。现有技术虽然有关于敲除蛋白酶基因用于增加异源蛋白表达量的研究，但是仍存在表达量提高不显著、重组菌株传代不稳定等问题，本领域需要进一步探索通过敲除蛋白酶基因来增加异源蛋白表达量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酿酒酵母蛋白酶缺失菌株的构建及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种重组酵母菌株，所述重组酵母菌株的基因组中整合有表达外源蛋白的表达盒，并且，所述重组酵母菌株的内源的蛋白酶基因被敲除；所述的蛋白酶包括：Pep4、Yap3、Prb1和CYM1。

在另一优选例中，所述的外源蛋白选自下组：GLP-1、GLP-2、胰高血糖素、肠激酶、腺苷脱氨酶、α/β-葡萄糖苷酶、谷胱甘肽还原酶。

在另一优选例中，所述的外源蛋白为GLP-1及其类似物。

在另一优选例中，所述GLP-1类似物包括GLP-1截短和/或N-末端延伸的形式和/或部分氨基酸突变形式。

在另一优选例中，所述的GLP-1类似物为SEQ ID NO:6(Arg34GLP-1（7-37）)、SEQID NO:7（Arg34GLP-1（9-37））所示的多肽。

在另一优选例中，所述表达盒中包含的外源蛋白的编码序列是经密码子优化以在酿酒酵母中表达的序列。

在另一优选例中，所述的重组酵母菌株为重组酿酒酵母菌株。

在另一优选例中，所述的酵母菌株包括BY4741和BY4742及其二倍体。

在另一优选例中，所述的重组酵母菌株包括单倍体菌株和二倍体菌株。

在另一优选例中，所述的Pep4的编码基因如SEQ ID NO: 9所示，所述的Yap3的编码基因如SEQ ID NO: 10所示，所述的Prb1的编码基因如SEQ ID NO: 11所示，和/或所述的CYM1的编码基因如SEQ ID NO: 12所示。

在另一优选例中，所述表达外源蛋白的表达盒从5’到3’依次包括：抗性标记编码序列、启动子序列、α factor、外源蛋白编码序列、终止子序列。