[发明专利]一种诱导表达绿色荧光蛋白广宿主质粒的构建及其在荧光示踪中的应用

说明书

本发明公开了一种诱导表达绿色荧光蛋白广宿主质粒的构建及其在荧光示踪中的应用。本发明所述的pBT‑iEGFP质粒，是基于广宿主质粒pBBR1MCS骨架构建而成，包含有四环素阻遏蛋白TetR、四环素启动子Pzt‑1和增强型绿色荧光蛋白EGFP序列。具有广宿主的特性，至少可以在大肠杆菌属细菌、沙门菌属细菌以及布鲁菌属细菌中复制，但不限于上述几种细菌。包含有该质粒的细菌在特定浓度无水四环素诱导条件下，可以诱导宿主细菌发出绿色荧光。具有多种细菌通用性、可控表达性、特定示踪活菌、强荧光等优点。该质粒可以用于多种细菌的荧光标记，细菌形态学观察以及荧光动态示踪等技术。

技术领域

本发明为基因工程领域，具体地说，本发明涉及到一种可诱导表达增强型绿色荧光蛋白的广宿主质粒pBT-iEGFP的构建方法，该质粒可以在禽致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和马耳他布鲁菌中稳定遗传，在加入无水四环素条件下，可高效表达增强型绿色荧光蛋白。本质粒基于广宿主质粒而构建，可用于多种细菌，不仅仅用于大肠杆菌、沙门菌和布鲁菌的荧光示踪。

背景技术

荧光蛋白常用来标记并示踪特定蛋白、病毒或细菌的发光蛋白，与荧光抗体标记相比，其成本低、操作方便、荧光强度高且背景值低等特点。目前市场上用于荧光标记的蛋白较多，如绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白mCherry和DsRed、蓝色荧光蛋白BFP、黄色荧光蛋白YFP等。本发明中使用的是增强型绿色荧光蛋白EGFP，其荧光强度更强，更加利于观察。

大肠杆菌工程菌，如DH5α，是一种常用的用来表达外源蛋白或进行基因工程操作的工具菌种，方便利用化学转化的方法进行基因操作，也方便评估目的基因的表达情况等。禽致病性大肠杆菌是感染家禽的一种重要的细菌性病原，由多种血清学致病性大肠杆菌感染所引起，临床症状包括气囊炎、肝周炎和心包炎等。鼠伤寒沙门菌是一种重要的人畜共患的病原菌，主要导致食物中毒，在婴幼儿中，病死率较高。布鲁菌同样是一种重要的人畜共患细菌性病原，感染孕畜导致流产，感染人引起波浪热，对公共卫生和畜牧业发展造成巨大影响。

细菌的荧光标记是一种重要的常见的实验标记技术，用于研究细菌生理生化特性、宿主体内示踪、细菌感染细胞示踪、致病机制研究等。不同种属的细菌，如大肠杆菌、沙门菌和布鲁菌等，通常构建有自己专用的荧光标记质粒，尽管在单独使用时，具有显著的荧光活性，但由于质粒的复制特性，启动子的种类不同，不同细菌需要不同类型的质粒，而且同一质粒在不同种属细菌间不能通用，如在大肠杆菌中能表达荧光的质粒，在布鲁菌中却不能使用，甚至会被降解，而在布鲁菌中能表达荧光的质粒，在大肠杆菌和沙门菌中并不能兼容。此外，市场上用于大肠杆菌、沙门菌和布鲁菌的荧光质粒大多为持续性表达荧光质粒，在感染过程中，无论死菌或活菌都能发出荧光，不能有效区分感染的细菌是活菌还是死菌。因此，构建一个多种细菌通用型的质粒，并可控表达荧光蛋白，可用于示踪感染中的活菌，具有十分重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术中的技术缺陷，本发明作出如下技术贡献，

本发明首先提供一种pBT-iEGFP质粒载体，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列

进一步的，本发明提供一种荧光示踪质粒的制备方法，所述方法以广宿主质粒pBBR1MCS (Kovach ME, Phillips RW, Elzer PH, Roop RM, 2nd, Peterson KM.pBBR1MCS: a broad-host-range cloning vector. BioTechniques, 1994; 16: 800-802.) 为骨架，将阻遏蛋白TetR和四环素启动子Pzt-1和增强型绿色荧光蛋白EGFP串联，构建成一个新的用于可诱导表达绿色荧光蛋白的广宿主质粒pBT-iEGFP。