[发明专利]一种诱导表达绿色荧光蛋白广宿主质粒的构建及其在荧光示踪中的应用

权利要求书

1.pBT-iEGFP质粒载体，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的pBT-iEGFP质粒的构建方法，其特征在于，包含如下步骤：

1）以pZT-EGFP质粒为模板，iEGFP-F 和iEGFP-R为引物，PCR扩增诱导性表达绿色荧光蛋白片段TetR-Pzt-1-iEGFP，引物序列如下：

iEGFP-F: AGGGAACAAAAGCTGGGTACCCCGTTTCCATTTAGGTGGGTA

iEGFP-R: CGCGGTGGCGGCCGCTCGATCGATTATTTATTTCCTG

2）使用限制性内切酶KpnI和XbaI双酶切广宿主质粒pBBR1MCS，经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收试剂盒回收线性化pBBR1MCS质粒；

3）无缝克隆试剂盒连接TetR-Pzt-1-iEGFP片段和pBBR1-MCS线性化质粒，产物转化至大肠杆菌DH5α中，PCR鉴定阳性克隆，测定正确的质粒命名为pBT-iEGFP质粒。

3.权利要求1所述质粒转化至大肠杆菌属细菌中诱导表达绿色荧光蛋白。其特征在于，包含如下步骤：

1）大肠杆菌工程菌DH5α化学转化方法：取100 µL大肠杆菌感受态细胞，冰水混合物上慢慢融化，加入20 ng pBT-iEGFP质粒，混合均匀后，冰浴30 min，42 ℃热激90 s，冰浴2min，加入1 mL LB溶液，37 ℃震荡培养45 min，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆菌株接种氯霉素LB溶液中，分别加入0~100 ng/mL不同浓度的无水四环素诱导12 h，取500µL培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5~10 µL悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。

2）禽致病性大肠杆菌AH50电转化方法：LB培养禽致病性大肠杆菌AH50至对数生长前期（OD₆₀₀= 0.4~0.6），冰浴10 min，无菌预冷水洗涤菌体两遍，预冷的10 %甘油无菌水悬浮细菌，每管分装100 µL，加入1 µg pBT-iEGFP质粒，冰浴10 min，将混合物加入1 mm电转化杯中，冰浴10 min，1.8 kV 200 Ω条件下，将质粒电转化至禽致病性大肠杆菌AH50中，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆菌株接种氯霉素LB溶液中，分别加入0~100 ng/mL不同浓度的无水四环素诱导12 h，取500 µL培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5~10 µL悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。

4.权利要求1所述质粒转化沙门菌属细菌中诱导表达绿色荧光蛋白。其特征在于，包含如下步骤：

将鼠伤寒沙门菌SL1344 在LB中培养至对数生长前期(OD₆₀₀= 0.4~0.6)，冰浴10 min，无菌预冷水洗涤菌体两遍，预冷的10 %甘油无菌水悬浮细菌，每管分装100 µL，加入1 µgpBT-iEGFP质粒，冰浴10 min，将混合物加入1 mm电转化杯中，1.8 kV 200 Ω条件下，将质粒电转化至SL1344中，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆菌株接种氯霉素LB溶液中，分别加入0~100 ng/mL不同浓度的无水四环素诱导12 h，取500 µL培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5~10 µL悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。