[发明专利]高效分离小鼠肌内纤维-成脂祖细胞的方法

说明书

本发明公开了一种高效分离小鼠肌内纤维‑成脂祖细胞的方法，步骤包括：（一）胶原蛋白涂层培养皿；（二）小鼠骨骼肌的分离和消化；（三）差异贴壁分离FAP。通过细胞流式分析及油红O染色确定分离的细胞纯度高，分化潜能高，增殖速度快，存活率高；采用胶原蛋白涂层培养皿利于细胞贴附，大大缩短分离时间，提高细胞得率；所使用的C57BL/6小鼠来源广泛，较易得到，大大减小了实验方法复现的难度。且相比于传统的流式分选法，不需要流式分选仪，更加经济实惠，方便快捷；为研究骨骼肌的发育和再生中纤维/成脂祖细胞功能提供良好的细胞基础。

技术领域

涉及细胞分离及培养分化技术，具体涉及一种小鼠肌内纤维-成脂祖细胞（Fibro-Adipogenic Progenitors，FAP）高效分离的方法。

背景技术

骨骼肌是健康人类中最丰富的组织，占体重的40％。在生理过程中起着至关重要的作用，包括运动功能，产能和呼吸等。它由称为肌纤维的多核收缩细胞组成，在分化过程中通过分化的单核肌肉细胞融合形成，并且其数量在出生后的生长过程中保持恒定。

骨骼肌由大量不同种类的细胞组成，它们相互作用以维持肌肉的动态平衡和协调再生。骨骼肌的再生潜力主要取决于卫星细胞（SCs），除此之外SC与肌肉生态位内其他细胞类型（包括运动神经元、内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞和成脂前体细胞）之间功能性串扰的建立对于肌肉修复和体内平衡同样至关重要。

纤维-成脂祖细胞是驻留在骨骼肌中的多能祖细胞。在骨骼肌的发育和再生过程中，FAP为肌纤维成熟和规范所需的成肌祖细胞提供营养支持。FAPs还是退行性疾病状态中纤维化的主要细胞来源，研究显示它还在衰老过程中的骨骼肌脂肪浸润和肌肉功能损伤中的纤维化等病理过程发挥重要作用。FAP是再生中必不可少的细胞，并且在维持再生环境中起着至关重要的作用。因此，有效和可重复的分离和培养高纯度FAP种群的方法对于进一步了解这些细胞的发育生物学，药物筛选和疾病建模至关重要。但是在现有的技术中，主要是通过流式细胞分选的方法得到FAP，该方法成本高昂，且分选过程影响细胞存活率和细胞干性，不利于后续研究。

发明内容

针对上述细胞分离技术存在的不足之处，本发明的目的是提供一种高效分离小鼠肌内纤维-成脂祖细胞的方法。

一种高效分离小鼠肌内纤维-成脂祖细胞的方法，步骤如下：

（一）胶原蛋白涂层培养皿

将2mL胶原蛋白添加到10cm细胞培养皿中，覆盖细胞培养皿表面，之后将细胞培养皿在通风橱中放置过夜干燥；

（二）小鼠骨骼肌的分离和消化

（2.1）选取平均月龄为2-3月大的C57BL/6小鼠，断颈法人道处死小鼠并在75%酒精浸泡消毒5min；

（2.2）在无菌操作台取出小鼠后肢肌肉，放在细胞培养皿上，倒入3mL 4°C预冷含100 U mL ^-1青霉素/链霉素的PBS溶液；

（2.3）将肌肉中其他组织剔除；

（2.4）用手术剪刀将修整后的肌肉切成粗浆，将切碎的组织浆液转移到15mL锥形管中；

（2.5）加10mL的0.2％胶原酶II型溶液进行消化；在37°C下孵育1小时，530g离心5分钟；

（2.6）吸出上清液，重悬于10mL 37°C预热的分散酶中；在37°C下孵育45分钟，以530g离心 5分钟，然后用GM终止消化；

（2.7）吸出上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL GM中，并用70μm细胞过滤器吸移重悬物；

（2.8）依次通过18G，23G和27G针抽吸，每个规格抽吸两次，使细胞悬浮液进一步解离；

（三）差异贴壁分离FAP