[发明专利]高效分离小鼠肌内纤维-成脂祖细胞的方法

权利要求书

1.一种高效分离小鼠肌内纤维-成脂祖细胞（Fibro-Adipogenic Progenitors，FAP）的方法，其特征在于，步骤包括：

（一）胶原蛋白涂层培养皿

将2mL胶原蛋白添加到10cm细胞培养皿中，覆盖细胞培养皿表面，之后将细胞培养皿在通风橱中放置过夜干燥；

（二）小鼠骨骼肌的分离和消化

（2.1）选取平均月龄为2-3月大的C57BL/6小鼠，断颈法人道处死小鼠并在75%酒精浸泡消毒5min；

（2.2）在无菌操作台取出小鼠后肢肌肉，放在细胞培养皿上，倒入3mL 4°C预冷含100 UmL^-1青霉素/链霉素的PBS溶液；

（2.3）将肌肉中其他组织剔除；

（2.4）用手术剪刀将修整后的肌肉切成粗浆，将切碎的组织浆液转移到15mL锥形管中；

（2.5）加10mL的0.2％胶原酶II型溶液进行消化；在37°C下孵育1小时-1小时30分钟，530g离心5分钟；

（2.6）吸出上清液，重悬于10mL 37°C预热的分散酶中；在37°C下孵育45分钟，以530g离心 5分钟，然后用GM终止消化；

（2.7）吸出上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL GM中，并用70μm细胞过滤器吸移重悬物；

（2.8）依次通过18G，23G和27G针抽吸，每个规格抽吸两次，使细胞悬浮液进一步解离；

（三）差异贴壁分离FAP

（3.1）将细胞悬液接种于10cm培养皿并在37°C，5％CO₂培养箱中孵育4小时，标记为P1；

（3.2）将含有非贴壁细胞的培养基转移到第二个有胶原涂层的培养皿中，标记为P2，并在P1培养皿中补充5mL GM，将培养皿放回培养箱；

（3.3）18小时后，吸出P2中的培养基，并补充5mL GM，将P1和P2培养皿放在培养箱中培养2-3天，即得到纤维/成脂祖细胞；

步骤（2.5）中0.2％胶原酶II型消化溶液酶为500U/mL；

所述的GM为补充有20％（vol / vol）FBS，0.5％（vol / vol）CEE和100 U mL ^-1青霉素/链霉素的DMEM，并通过0.22μm无菌滤头过滤；

步骤（3.1）中培养箱孵育时间以4-6小时为宜。