[发明专利]一种大规模快速分离纯化rhTNK-tPA I/II型的方法

说明书

本发明属于蛋白分离纯化技术领域，具体涉及一种大规模快速分离纯化rhTNK‑tPA I/II型的方法。本发明提供了一种适合分离rhTNK‑tPA I/II型的层析方法，使得分离同等量的rhTNK‑tPA I/II型的层析时间较公开技术减少50％以上，实现了短时间内高效处理和大规模制备rhTNK‑tPA I/II型的目标。分离后的rhTNK‑tPA I型冻干成品经SDS‑PAGE检测I型比例95％，比活为3.3×10⁵IU/mg；rhTNK‑tPA II型冻干成品经SDS‑PAGE检测II型比例为100％，比活为6.5×10⁵IU/mg。

技术领域

本发明属于蛋白分离纯化技术领域，具体涉及一种大规模快速分离纯化rhTNK-tPAI/II型的方法。

背景技术

TNK-tPA是迄今为止最安全有效且使用最方便的溶栓药，国内上市的第一代重组天然t-PA类产品，即阿替普酶，完全依赖进口，商品名“爱通立”，50mg/支。而采用大肠杆菌表达的第二代t-PA类产品，即瑞替普酶，由山东阿华生产的“瑞通立”和北京爱德药业开发的“派通欣”分别于2007年和2010年获准上市。而广州铭康生物工程有限公司生产的第三代t-PA类产品—重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂(rhTNK-tPA，商品名：铭复乐)，是国际最新一代溶血栓药物，填补国内空白，具有开通率高、出血率低、使用便捷、不需要冷链运输等诸多优势，也是目前唯一可以单次静脉推注的溶栓药品种，更加适合急救，使得溶栓治疗在院外进行成为可能。

rhTNK-tPA是天然t-PA的点突变体，分子中3个位点Thr103、Asn117和Lys296-His-Arg-Arg299分别被Asn、Glu和Ala-Ala-Ala-Ala代替。通过突变，原117位N-连接的糖链变为103位N-连接的糖链。因此，rhTNK-tPA含有3个可能的N-糖基化位点：Asn103，Asn184，Asn448。根据糖基化方式可将rhTNK-tPA分成两个亚型：I型在Asn103，Asn184，Asn448三个位点均发生糖基化，II型则在Asn184位点无糖基化。

由于rhTNK-tPAI/II型的活性水平不同，会对临床效果有影响。因此，需对rhTNK-tPA中I/II的比例时进行持续的监控，确保其在一个合格的范围，保障药品的安全性和有效性。

参照同类品种注射用阿替普酶的欧洲药典标准，检测rhTNK-tPA中I/II型含量可采用SDS-PAGE法(标曲法)：通过rhTNK-tPAI/II型标准品建立标准曲线，将待测样品的数值代入标准曲线，计算出待测样品的I型/II型比例。

因此，为了建立rhTNK-tPAI/II型含量检测方法，首先需要制备rhTNK-tPA I/II型标准品。同时由于长期监控的需要，分离方法必需满足长期使用量的要求。而目前尚无成熟的技术对rhTNK-tPAI/II型进行分离，大规模制备非常困难。为此，需要开发rhTNK-tPAI/II型标准品大规模制备方法。现有技术中尚无公开的rhTNK-tPAI/II型分离方法。仅有公开了t-PA的I/II型分离的层析方法，如WO 89/09820专利，George利用Lysine Sepharose 4B分离得到t-PAI/II型。该方法采用的层析柱，耗时较长，仅洗脱步骤需要约33h，且分离得到的t-PAI型或t-PAII型均未检测I/II型比例。另外，该方法处理1g蛋白时就需要用到100cm的长层析柱，存在工艺放大困难。更进一步，当处理量大时，洗脱时随着蛋白流出浓度的增大，UV值一直处于检测上限，以致出现平台峰的情况，不能很好地根据峰型收集目标蛋白。综上，该方法不适用于工艺进一步放大和大规模分离。

由于rhTNK-tPA的184糖基化位点位于K2区，该位点的糖基化会影响K2区的构象，进而影响K2区与赖氨酸的结合能力。本发明在rhTNK-tPA原液的基础上(rhTNK-tPA原液的制备过程见专利ZL201010263862.5)，利用赖氨酸特异性结合能力的差异分离得到rhTNK-tPAI/II型。

发明内容