[发明专利]一种大规模快速分离纯化rhTNK-tPA I/II型的方法

权利要求书

1.一种大规模快速分离纯化rhTNK-tPA I/II型的方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1、将rhTNK-tPA原液经注射用水稀释4~8倍，获得稀释后的rhTNK-tPA原液；

S2、用平衡缓冲液A平衡Lysine HyperD层析柱后，将步骤S1所得稀释后的rhTNK-tPA原液上样，上样后再用平衡缓冲液A进行后平衡，平衡后用洗脱液a进行2CV线性洗脱，洗脱过程出现两个峰时，分段收集I型目标峰和II型目标峰；

S3、采用SDS-PAGE法检测S2目标峰收集液中rhTNK-tPA I型或II型的比例，选择比例＞95%的收集液再分别进行下一步层析；

S4、用平衡缓冲液B平衡Sephadex G-25层析柱后，将步骤S3得到的rhTNK-tPA I型或rhTNK-tPA II型收集液直接上样，上样体积为20~30% CV，以洗脱液b进行洗脱，收集目标峰，即得到rhTNK-tPA I型原液或rhTNK-tPA II型原液；

S5、将步骤S4收集到的rhTNK-tPA I型原液或rhTNK-tPA II型原液进行稀配，用洗脱液b稀释至蛋白浓度0.3mg/ml后，采用10ml西林瓶进行除菌灌装、冻干、轧盖，装量均为0.3mg/支，即得到rhTNK-tPA I型或rhTNK-tPA II型冻干成品；

S6、采用紫外检测法检测冻干成品的蛋白含量，SDS-PAGE法检测冻干成品中I/II型比例，LC-MS标定冻干成品的纯度，即获得rhTNK-tPA I型或rhTNK-tPA II型标准品；

所述步骤S2中的平衡缓冲液A的组分为20mM PBS、0.04%聚山梨酯80，pH8.0±0.1，其用量为1.5~3.0 CV；

所述步骤S2中洗脱液a由以下浓度的组分组成：10~20mM PBS，0.05~0.15M EACA氨基己酸，1~3M Urea尿素，洗脱液的pH值为8.0±0.1，用量为1.5～3.0 CV；

所述步骤S2中层析柱规模为φ3.5cm×24cm；

所述步骤S4中平衡缓冲液B的组分为50~60g/L精氨酸、0.02~0.06%聚山梨酯80，pH7.4±0.1；

所述步骤S4中洗脱液b由以下浓度的组分组成：50~60g/L精氨酸、0.02~0.06%聚山梨酯80，pH7.4±0.1。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中稀释后使上样样品电导为0~10mS/cm，调节pH至8.0±0.1。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S6检测到的rhTNK-tPA I型冻干成品的I型比例为96.7%，比活性为3.3×10⁵IU/mg；分离纯化后的rhTNK-tPA II型冻干成品的II型比例为100%，比活为6.5×10⁵IU/mg。