[发明专利]一种用于药物筛选的受体色谱载体的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于药物筛选的受体色谱载体的制备方法，将SpyCatcher纯化蛋白偶联至载体介质上作为通用载体，在受体蛋白序列中添加SpyTag标签并重组表达，利用SpyTag/SpyCatcher自连系统的固定化方式，通过共同孵育将带SpyTag标签受体蛋白的细胞裂解液中以捕获方式结合并定向固定到载体上，实现受体色谱载体的快速制备。该方法避免了针对不同受体蛋白的纯化过程，可适用于不同受体蛋白对应的色谱载体制备，并且受体定向固定、结合牢固、在生理条件下结合固定故能保持受体最佳活性，因而具有便捷性、通用性和实用性。

(一)技术领域

本发明涉及一种用于药物筛选的受体色谱载体的制备方法。

(二)背景技术

在药物的早期发现和设计过程中，许多天然植物、海陆动物、微生物等成为潜在先导药物发现的重要来源，如青蒿素、抗体、青霉素、阿糖胞苷等。然而，这些生物来源的先导药物往往作为植物汁液、动物体液、组织液、菌液等复杂成分的一份子，和成千上万的其他具有活性的化学物质共存，使得它们难以被鉴别、筛选，并进一步评估其药用价值。随着基因工程和蛋白质工程的发展，尤其是各种原核真核表达系统的建立，可基因编码的多肽或蛋白类药物的开发也达到了前所未有的高度。然而，这些系统表达出来的目的活性成分，也常常是和其他细胞组分甚至培养基组分混杂在一起，后续需要冗长的分离和筛选过程。

受体色谱，属于亲和色谱的一种，是将受体高特异性识别并结合潜在药用活性物质的特性和色谱技术的高分离特性相辅相成所形成的一种具有高度靶向分离特性的色谱。由于受体色谱兼具受体特异性识别能力和色谱的高效分离能力，相对于传统色谱分离技术来说具有高特异性、高灵敏度、高分离效率等优点，因此受体色谱的应用可以大大提高对各种复杂混合物中药用活性物质的筛选效率。

受体色谱的制备，其关键在于受体色谱载体的制备。在国内外主流的受体色谱载体制备策略里，主要区别在于受体配基的制备，固定化载体的选择，和受体配基的固定化方式上。

受体配基制备方式主要有两大类，从生物原材料直接提取和通过基因重组方式异源表达。直接提取法可以从原材料直接分离获得天然活性的受体蛋白，但存在提取总量少、原材料浪费严重等问题。而利用基因重组表达的方式，受体的制备成本低、制备量大，可在受体蛋白序列中添加纯化标签(如His标签)，方便后续纯化过程。但是，不论是通过直接提取或重组表达方式制备受体配基，后续的纯化过程依然不可避免。

对于受体色谱来说，能保持受体固定后的活性，是至关重要的，因此那些天然来源的载体材料比如琼脂糖、葡聚糖、纤维素，以及无毒的化学惰性材料如硅胶，非常适合作为受体色谱的固定化载体介质。近些年来，生物相容性磁珠也备受关注。磁珠分离的最大特点，就是整个磁性操作过程，无论是对固定的配基蛋白或是样品中的生物活性蛋白来说，都是无损、温和的，可以最大限度地保留蛋白的活性。而且，基于磁珠的操作方法是简单快速的，磁珠材料常用于高通量自动化，非常适合进行规模化筛选。

目前主要的受体蛋白固定化方式分为三种：物理吸附，化学共价偶联，和生物亲和特异性相互作用。物理吸附的固定方式为随机固定并且容易发生受体蛋白解吸附；共价偶联法对受体的固定更为牢固，但依然存在多位点固定的问题，影响受体蛋白活性；生物亲和标签介导的固定方式，其反应条件温和，对固定位点的选择特异性好，但是绝大多数属于非共价键，在使用过程中依然可能发生受体脱落。因此，亟需一种能保持受体最佳活性、对固定位点选择特异性好、固定方式更为牢固的受体配基固定化策略。