[发明专利]一种用于药物筛选的受体色谱载体的制备方法

权利要求书

1.一种用于药物筛选的受体色谱载体的制备方法，其特征在于所述方法包括：

(1)将SpyCatcher纯化蛋白偶联至载体介质上作为通用载体；

(2)在受体蛋白基因序列中添加SpyTag标签并重组表达，制备含SpyTag标签受体蛋白的细胞裂解液上清；

(3)将通用载体与带SpyTag标签的受体蛋白的细胞裂解液上清，共同孵育，获得受体色谱载体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述偶联的方法包括乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺/N-羟基硫代琥珀酰亚胺法或环氧化合物介导的偶联法。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的载体介质包括磁珠或琼脂糖。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述SpyCatcher纯化蛋白按如下方法制备：将标记有His标签的SpyCatcher基因序列插入pET30a质粒中，随后将该重组质粒通过热休克法导入感受态大肠杆菌BL21(DE3)；吸取菌液均匀涂布在含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养基上，于37℃倒置培养12～16h直至单菌落出现；挑取单菌落测序筛选到阳性克隆后，将阳性单菌落接入装有含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中，设置转速180rpm，振摇培养过夜；将过夜培养的菌液按体积浓度1％的接种量接种至预先装有含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温培养振荡摇床中，设置180rpm转速振荡培养至OD600为0.5-0.6；随后在0.1-1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导浓度下，于20-37℃诱导培养1-24h，离心，取菌体，用磷酸盐缓冲液重悬，超声破碎，获得含有SpyCatcher蛋白的细胞裂解液；将裂解液通过镍柱进行纯化，经线性梯度洗脱，收集洗脱峰，透析，随后用超滤管浓缩，得到SpyCatcher纯化蛋白。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导浓度为0.40mmol/L，诱导温度为37℃，诱导培养时间为10h。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述含SpyTag标签的受体蛋白的细胞裂解液上清按如下方法制备：将含有SpyTag标签的受体蛋白基因序列的pET28a质粒通过热休克法导入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中；取菌液均匀涂布在含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养基上，于37℃倒置培养12～16h直至单菌落出现；通过祧单菌落测序筛选到阳性克隆后，将阳性单菌落接入装有含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中，设置转速180rpm，振摇培养过夜；将过夜培养的菌液按体积浓度1％的接种量接种至预先装有含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温培养振荡摇床中，设置180rpm转速振荡培养至OD600为0.5-0.6；随后在0.1-1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导浓度下，于20-37℃诱导培养1-24h，离心，取菌体，用磷酸盐缓冲液重悬，超声破碎，离心，获得含有SpyTag标签的受体蛋白的细胞裂解液上清。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述超声破碎在超声波细胞粉碎机中进行，超声条件为：超声2秒，间歇4秒，功率300瓦，超声时间20分钟。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述共同孵育温度为4-37℃。