[发明专利]一种耐盐燕麦新种质的创制方法

说明书

本发明公开了一种耐盐燕麦新种质的创制方法，属于植物基因工程技术领域。本发明公开的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，将外源基因GUS和PeNAC1转入六倍体燕麦中，得到转基因植株。经检测表明，外源基因在不同转基因株系中得到了不同程度的表达，赋予转基因株系耐盐性，并成功获得具有目的性状的转基因新种质。这表明本发明建立的燕麦遗传转化方法可以用于燕麦基因功能研究及燕麦转基因新品种培育。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种耐盐燕麦新种质的创制方法。

背景技术

燕麦因其不与主要粮食作物争耕地的特性成为农业种植结构调整中重要的特色小宗作物。同时，燕麦主要种植在干旱少雨、土壤瘠薄的干旱半干旱荒漠地区，因此，选育抗旱耐盐品种对扩大燕麦种植面积，提高土地利用效率有重要意义。转录因子(TFs)因其具有调控多种胁迫途径应答基因表达操纵复杂性状的功能成为利用基因工程改善植物非生物胁迫耐受性的重要候选基因。NAC蛋白是最大的植物特异性TF家族之一。迄今为止，已经从水稻，小麦，玉米，大麦，杨树等植物中鉴定出一定数量的与非生物胁迫相关的NAC蛋白并成功地开发了同源/异源表达的转基因植物，这些植物经过改造后可以提高非生物胁迫耐受性。例如，过表达水稻NAC基因ONAC5/6/9和ONAC10提高了水稻干旱胁迫条件下耐旱性并减少了谷物损失。过表达ONAC14提高了水稻耐旱性，转基因植物在干旱条件下具有更高的穗数和充实率。水稻SNAC1改造的转基因棉花植株对干旱和盐分胁迫表现出增强的耐受性。通过在玉米泛素启动子的控制下将SNAC1引入小麦，提高了小麦对干旱和盐胁迫的耐受性。这表明来源于高度耐盐的“盐生植物”或耐盐种质/品种中的NAC基因具有通过基因工程改善植物非生物胁迫耐受性的潜力。

因此，提供一种耐盐燕麦新种质的创制方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种耐盐燕麦新种质的创制方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种耐盐燕麦新种质的创制方法，具体步骤如下：

(1)将胡杨NAC蛋白PeNAC1的全长编码区插入表达载体pCAMBIA1304，与mgfp5和gus基因形成pCAMBIA：PeNAC1-mgfp5-gus融合构建体质粒；所述PeNAC1的全长编码区序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)用PeNAC1启动子取代所述pCAMBIA：PeNAC1-mgfp5-gus中的35S启动子，获得重组表达载体pCAMBIA-ProNAC1:PeNAC1-mgfp5-gus；所述PeNAC1启动子序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)将所述重组表达载体pCAMBIA-ProNAC1:PeNAC1-mgfp5-gus转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，划线培养，挑取单菌落培养，提取质粒；

(4)在燕麦自花授粉前将步骤(3)所述质粒刷在柱头上，具体操作如下：在扬花前雄蕊微黄未散粉时选择燕麦主穗进行整穗，每穗保留8-10个小穗；搓开燕麦小穗的颖壳，让柱头露出，将不同浓度的质粒溶液用锋径2mm的毛笔刷在柱头上，每次柱头上的用量为10μl；刷完质粒后，不需要去除雄蕊，套袋，做标记，自然结实后按照质粒转化的不同浓度收获种子；

(5)转基因燕麦筛选鉴定，具体操作如下：对T₀代种子表面进行灭菌，在添加有潮霉素的1/2MS培养基上生长；将抗潮霉素的转基因燕麦种质移植到土壤中，使其自花授粉以生产T₁；通过PCR鉴定，培育至T₂代；盐胁迫处理筛选得T₃代种子进行GUS染色，Northern杂交鉴定燕麦转基因株系。

进一步，步骤(3)在含100μg/ml Kan的LB培养基上划线培养，37℃恒温培养16-20h；挑取单菌落37℃，200rpm摇菌7-8h，使用TIANprep微型质粒试剂盒提取质粒。