[发明专利]一种耐盐燕麦新种质的创制方法

权利要求书

1.一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将胡杨NAC蛋白PeNAC1的全长编码区插入表达载体pCAMBIA1304，与mgfp5和gus基因形成pCAMBIA：PeNAC1-mgfp5-gus融合构建体质粒；所述PeNAC1的全长编码区序列如SEQID NO.1所示；

(2)用PeNAC1启动子取代所述pCAMBIA：PeNAC1-mgfp5-gus中的35S启动子，获得重组表达载体pCAMBIA-ProNAC1:PeNAC1-mgfp5-gus；所述PeNAC1启动子序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)将所述重组表达载体pCAMBIA-ProNAC1:PeNAC1-mgfp5-gus转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，划线培养，挑取单菌落培养，提取质粒；

(4)在燕麦自花授粉前将步骤(3)所述质粒刷在柱头上，具体操作如下：在扬花前雄蕊微黄未散粉时选择燕麦主穗进行整穗，每穗保留8-10个小穗；搓开燕麦小穗的颖壳，让柱头露出，将不同浓度的质粒溶液用锋径2mm的毛笔刷在柱头上，每次柱头上的用量为10μl；刷完质粒后，不需要去除雄蕊，套袋，做标记，自然结实后按照质粒转化的不同浓度收获种子；

(5)转基因燕麦筛选鉴定，具体操作如下：对T₀代种子表面进行灭菌，在添加有潮霉素的1/2MS培养基上生长；将抗潮霉素的转基因燕麦种质移植到土壤中，使其自花授粉以生产T₁；通过PCR鉴定，培育至T₂代，盐胁迫筛选得T₃代种子进行GUS染色，Northern杂交鉴定燕麦转基因株系。

2.根据权利要求1所述的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，步骤(3)在含100μg/ml Kan的LB培养基上划线培养，37℃恒温培养16-20h；挑取单菌落37℃，200rpm摇菌7-8h，使用TIANprep微型质粒试剂盒提取质粒。

3.根据权利要求1所述的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，步骤(4)所述质粒浓度为15，10，7.5，5.0，3.75，3.0，2.5，2.25，2，1.5ng/μl。

4.根据权利要求1所述的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，步骤(4)每一个柱头重复刷2次质粒溶液。

5.根据权利要求1所述的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，步骤(5)所述潮霉素浓度为25μg/ml。

6.根据权利要求1所述的一种耐盐燕麦新种质的创制方法，其特征在于，步骤(5)所述盐胁迫为用250mM NaCl溶液处理。