[发明专利]1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞作用的检测方法、应用

说明书

1,5,6‑三甲氧基‑2,7‑二羟基菲对HepG‑2细胞作用的检测方法、应用，属于医药技术领域，通过细胞划痕实验证实1,5,6‑三甲氧基‑2,7‑二羟基菲可抑制HepG‑2细胞的迁移；通过Hoechst33258荧光染色、AnnexinV‑FITC/PI双染、PI单染细胞凋亡检测均证实1,5,6‑三甲氧基‑2,7‑二羟基菲可诱导细胞凋亡；通过PI单染细胞周期方法证实，1,5,6‑三甲氧基‑2,7‑二羟基菲可诱导HepG‑2细胞G0/G1期阻滞，1,5,6‑三甲氧基‑2,7‑二羟基菲通过激活p53蛋白发挥抗肿瘤的作用，应用于制备治疗和/或预防肝癌的药物。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲基于p53靶点对HepG-2细胞的作用及其检测方法、应用。

背景技术

肝癌是指来源于肝细胞和肝胆管细胞的恶性肿瘤，分为原发性和继发性两大类，是我国常见的恶性肿瘤。早期肝癌常症状无特异性，中晚期肝癌的症状则较多，常见的临床表现有肝区疼痛、腹胀、纳差、乏力、消瘦，进行性肝大或上腹部包块等；部分患者有低热、黄疸、腹泻、上消化道出血等。原发性肝癌的治疗包括系统化疗、靶向治疗、生物治疗，继发性肝癌患者的治疗包括手术治疗，手术治疗无效时可采取保守治疗。

治疗方式的选择取决于肿瘤的位置、恶性程度、发展程度以及病人身体状态。肝癌的治疗无论是化疗、手术或放疗都是对身体有极大负担，并且在发生恶性转移后，无论是何种方式都是很难彻底治愈。随着癌基因、抑癌基因发现、细胞凋亡学说形成，对其了解也从细胞水平深入到分子水平。癌症与许多癌基因和抑癌基因的改变有关，研究与细胞凋亡有关信息传递、蛋白酶活性，有望为癌症治疗提供新手段。

近年来抑癌基因p53在研究上取得一些进展，以该靶点作为研究治疗癌症的靶点药物受到广泛关注。MDM2蛋白是p53最重要负调控因子，参与调控p53蛋白稳定性和活性、抑制细胞生长、诱导凋亡和调节细胞周期功能。但p53靶点和MDM2-p53蛋白与蛋白作用通路在制备治疗和/或预防人肝癌的抗肿瘤药物中的应用鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲基于p53靶点对肝癌HepG-2细胞作用的检测方法，同时提供其在在抗肝癌方面的应用。

为了实现上述目的，采用以下技术方案：

细胞凋亡是细胞程序型死亡方式之一，是细胞维持自身稳定的重要形式，无论是内源性细胞凋亡还是外源性细胞凋亡，都是通过p53靶基因诱导的。结合流式细胞仪、Hoechst 33258证实了1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲可以浓度依赖的诱导HepG-2细胞发生凋亡，并且将细胞周期阻滞在G0/G1期。这与正常细胞受到损伤时，激活p53通路抑制细胞周期促进受损的细胞DNA修复、促进细胞凋亡的表现一致。为进一步探讨1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲诱导HepG-2细胞发生凋亡的作用机制，通过Western Blot检测其对p53通路、Bcl-2家族(Bax、Bcl-2、Mcl-1)等蛋白表达的影响。结果表明，在HepG-2细胞中，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲增加了p53蛋白表达量，使Bax/Bcl-2比值升高，并且发现p53的下游靶基因MDM2的表达量降低。众所周知，p53与MDM2存在着负反馈调节，由于本发明中MDM2蛋白表达的降低，使p53蛋白在体内聚集，表达量升高，从而发挥其正常的生物学功能。因此，证明1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用于p53-MDM2通路，阻断了MDM2对p53的反向调节。为进一步证明1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲发挥抗肿瘤活性是否依赖于p53，对HepG-2细胞进行了细胞p53 siRNA敲减实验，结果表明p53 siRNA+Drug组细胞的存活率显著高于Control siRNA+Drug组，p53参与了1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞的抗增殖活性。基于以上研究表明，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲具有潜在开发抗肝癌的治疗药物。