[发明专利]1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞作用的检测方法、应用

权利要求书

1.1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞作用的检测方法，其特征在于，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲基于p53靶点对肝癌HepG-2细胞作用，包括以下步骤：

以下检测步骤不分先后顺序；

1、检测1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞增殖的影响；

1.1 MTT体外抗肿瘤活性的测定，检测HepG-2细胞的增殖和存活情况；

1.2 IncuCyte活细胞成像系统，检测细胞融合率；

2、检测1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞迁移的影响；

3、检测1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞凋亡的影响；

3.1 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡；

3.2 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡；

4、检测1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞周期的影响；

5、检测1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用于HepG-2细胞后体内相关蛋白变化情况；

5.1蛋白质印迹实验；

5.2小干扰RNA细胞转染实验。

2.根据权利要求1所述的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞作用的检测方法，其特征在于，所述步骤1.1MTT体外抗肿瘤活性的测定，具体包括：

(1)种板：按照4×10⁴个/ml的密度取HepG-2细胞，接种到96孔板中，进行细胞培养；

(2)给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长至50％-60％，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理；1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲浓度为1.56μM，3.125μM，6.25μM，12.5μM，25μM，50μM，100μM；

(3)MTT检测：避光加入MTT原液，混匀，培养箱中培养，弃旧的培养基，加入DMSO溶解甲瓒结晶，震荡，检测490nm波长处的OD值；

(4)计算细胞存活率：

其中，实验组为不同浓度的处理组，对照组为加入DMSO的组；

(5)化合物IC₅₀的测定。

3.根据权利要求1所述的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞作用的检测方法，其特征在于，所述步骤1.2IncuCyte活细胞成像系统，检测细胞融合率，具体步骤：

(1)种板：按照4×10⁴个/ml的细胞密度，取HepG-2细胞，铺板于96孔板中，分为对照组和1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组；

(2)给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞贴壁后，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理，方法同步骤1(2)；

(3)数据处理：将96孔板放置于IncuCyte活细胞成像系统内，定时采集细胞图像动态，计算不同处理条件下细胞融合率。

4.根据权利要求1所述的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞作用的检测方法，其特征在于，所述步骤2检测1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞迁移的影响，具体步骤：

(1)种板：按照4×10⁴个/ml的细胞密度，取HepG-2细胞，铺板于96孔板中，进行细胞培养；

(2)划痕及给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长满后，弃掉培养基，进行划痕，缓冲液冲洗，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理浓度为0.4μM；

(3)数据处理：在IncuCyte活细胞成像系统中，不同时间点进行拍照，分析细胞各个时间点的迁移率。