[发明专利]一种过表达miR-13474工程化外泌体及其制备方法与应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种过表达miR‑13474工程化外泌体及其制备方法与应用。本发明基于RNA测序技术，筛选差异表达miRNA分子，验证锁定关键分子miR‑13474。发现miR‑13474可增强DFL和HUVEC细胞活性、增殖能力、迁移能力，并促进HUVEC细胞成小管能力。对糖尿病足（DFU）大鼠模型创面具有明显的修复作用。本发明通过电穿孔技术制备miR‑13474过表达工程化外泌体，制备方法效率高，技术可推广程度高且能迅速制备大量携载不同类型外源物质的外泌体，具有极高的应用价值。本发明为糖尿病足治疗提供新方案，为临床转化提供支撑。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种过表达miR-13474工程化外泌体及其制备方法与应用。

背景技术

糖尿病足部溃疡（DFU）是糖尿病最常见和最严重的并发症之一，其会导致足部循环和感觉障碍，致使截肢或合并全身严重感染而死亡。目前主要通过血糖控制、减轻患肢负重、局部外敷抗生素、清创术等方法治疗，传统方法虽有一定疗效，但尚不能妥善解决溃疡创面迁延不愈等问题。因此，积极探索 DFU治疗新方案具有重要科学意义与临床转化价值。

间充质干细胞（MSC）以其可塑性和强大旁分泌能力，在再生医学领域备受关注，成为治疗组织损伤和皮肤创面的有效手段。现有研究表明MSC 主要通过旁分泌参与组织损伤修复，而外泌体（exosomes，Ex）作为 MSC 发挥旁分泌作用的重要效应成分，能选择性地装载活性蛋白和 RNA 分子等生物活性分子，广泛参与细胞存活、血管新生、免疫调节等各种生物学过程。人脐带间质干细胞源外泌体可在﹣80℃保存，避免了MSC冻存复苏的不便，融解后即可使用，使用时间易于掌握。且与干细胞自身相比，外泌体具有生物相容性好、稳定性高、免疫原性低、可被工程化改造等特点与优势，成为组织损伤“非细胞治疗（cell-freetherapy）”的新策略。

外泌体携载的miRNAs在所有小 RNA 分子中所占比例高，因富集的 miRNA 不被高温、酸碱和酶所破坏而具有较好稳定性，在基因表达调控中具有广泛而重要的作用。但目前尚无有关miR-13474用于创面治疗领域的相关报道，更无miR-13474高表达的外泌体用于糖尿病足创面修复治疗领域的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种过表达miR-13474工程化外泌体及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

在本发明的一个方面，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞源外泌体miR-13474，所述miR-13474的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其成熟编码序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供了外泌体miR-13474在制备用于治疗促进伤口愈合的药物中的用途。

进一步地，所述的外泌体miR-13474在制备用于治疗糖尿病足创面修复药物中的用途。

一种药物组合物，所述药物组合物中含有人脐带间充质干细胞源外泌体miR-13474以及药学上可接受的载体或佐剂。

在本发明的另一个方面，本发明还提供了一种工程化外泌体，所述的工程化外泌体中miR-13474 过表达分泌，并通过电穿孔途径富集。

进一步地，所述的工程化外泌体为人脐带间充质干细胞源外泌体。

进一步地，所述miR-13474的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其成熟编码序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种工程化外泌体的制备方法，其包括以下步骤：

将miR-13474和HucMSC-Ex充分混匀后加入到电极杯中，随后将电极杯放在电穿孔仪器的电极杯槽中进行电转，miR-13474进入HucMSC-Ex内得到过表达miR-13474的工程化外泌体。