[发明专利]一种检测赭曲霉毒素A的电化学发光免疫传感器的制备和应用

说明书

本发明公开了一种检测赭曲霉毒素A的电化学发光免疫传感器的制备和应用，在电极表面固载Au/CaCO₃纳米颗粒，然后在电极表面逐步修饰Ru(bpy)₃²⁺和Nb28，用BSA封闭非特异性结合位点，制得修饰电极。以该修饰电极作为工作电极，构建电化学发光免疫传感器，通过检测电化学发光信号对OTA进行定量分析，实现了OTA的高特异性、高灵敏度检测，同时也为纳米抗体在电化学发光技术领域的发展提供了参考。本发明电化学发光免疫传感器能够用于复杂基质咖啡、谷物等实际样品的检测应用，样品不需复杂的处理过程即可用于检测，解决了传统方法中样品前处理复杂、无法同时快速检测大量样品的问题。

技术领域

本发明涉及一种检测赭曲霉毒素A的修饰电极的制备方法及所得产品，还涉及一种检测赭曲霉毒素A的电化学发光免疫传感器，以及它们在检测赭曲霉毒素A中的应用，属于电致化学发光检测技术领域。

背景技术

赭曲霉毒素A（OTA）是一种由赭曲霉、黄曲霉等真菌产生的次级代谢产物，广泛存在于谷物、饲料、坚果、葡萄及葡萄酒、咖啡及其制品中。OTA性质稳定，不易分解，能长期在人和动物体内积累，不仅对肾脏、肝脏、神经系统损害极大，还具有致畸性和致癌性。由此可见， 灵敏的检测食物中的OTA的表达量对人类健康是非常重要的。1993年，国际癌症中心将OTA认定为2B类致癌物，随后，欧盟、美国等针对OTA在食品中的限量制定了标准，我国也针对谷物、豆类、葡萄酒、辣椒等制定了标准检测方法和严格的OTA限量标准。GB 5009.96 -2016规定了食品中OTA的标准检测方法，并针对不同检测方法规定了限量。

目前，OTA检测方法不断发展，薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附技术、时间分辨荧光免疫分析技术、胶体金免疫层析技术、化学发光酶免疫分析技术等检测技术日趋成熟。其中，薄层色谱法和胶体金免疫层析技术方法简单、检测成本低，但灵敏度也相对较低；高效液相色谱法的灵敏度高、重现性好，但成本高、操作过程复杂；酶联免疫吸附技术操作简单，但灵敏度低。

电化学发光检测技术（ECL）操作简单、灵敏度高、检测速度快、检测范围宽，成为了OTA定性、定量快速检测的新的发展方向。近年来，研究者们开发了大量的新型OTA电化学发光传感器，并且应用于小麦、玉米、葡萄酒等实际样品的检测，但大多是以OTA适配体为识别分子。例如，CN 101936940A公开了一种电化学发光适配体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，该方法使用OTA适配体作为识别元件，异鲁米诺作为发光试剂，检测范围为0-3 ng/mL，检测限为0.007 ng/mL，检测范围窄。为了构建灵敏度更高、特异性更好、检测范围更宽的ECL传感器，有研究者使用OTA抗体作为识别分子构建ECL免疫传感器，并用于橙汁样品的检测，但是OTA抗体储存条件苛刻，有机耐受力低，限制了该方法的广泛应用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种检测赭曲霉毒素A的修饰电极的制备方法，该方法首次尝试使用OTA纳米抗体作为识别分子构建修饰电极，该修饰电极作为ECL免疫传感器的工作电极时，具有高特异性、高灵敏度、检测范围宽的特点，且稳定性好，OTA纳米抗体有机耐受力能力高，应用范围更广。

OTA是极性小分子物质，需要用甲醇提取，难免会有甲醇残余，传统抗体（单克隆抗体或者多克隆抗体）结构复杂，对有机溶剂耐受度低，为了克服OTA传统抗体存在的不足，一些研究者开发了纳米抗体。纳米抗体是具有完整抗原识别能力的最小抗体片段，其分子量约为15 kDa左右。与传统抗体相比，纳米抗体分子量小、有较高的水溶性和稳定性、亲和力强、对甲醇耐受力强，抗基质干扰能力强。

本发明采用OTA纳米抗体Nb28作为识别元件，构建电化学发光免疫传感器，为纳米抗体在电化学发光技术领域的发展提供了参考。本发明具体技术方案如下：

一种检测赭曲霉毒素A的修饰电极的制备方法，该方法包括以下步骤：

（1）将蛋壳粉与HAuCl₄溶液混合在一起，使蛋壳粉充分吸收金离子；