[发明专利]含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体及其应用

说明书

本发明公开了一种含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型载体pCC_FR2‑2bPTⅢ，所述载体的CMV_Fny突变型RNA2核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的突变体与CMV_FnyRNA1、CMV_FnyRNA3混合接种，对CMV具有交叉保护效果；且突变型载体pCC_FR2‑2bPTⅢ至少可以容纳350bp的外源片段并保持遗传稳定性，为研发多价弱毒疫苗提供了更优化的基础载体，为田间防治CMV及其他病毒提供了疫苗材料和有效防治措施。

技术领域

本发明涉及植物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一种含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCC_FR2-2bPTⅢ的构建及其应用。

背景技术

植物病毒病素有植物“癌症”之称，是农作物的重要病害之一，每年给世界各地农作物造成不同程度的危害，仅在我国，每年由于病毒造成的损失高达300亿元(解昆仑等，2020)，防治植物病毒病一直是农业生产中的难题。黄瓜花叶病毒(cucumber mosaicvirus，CMV)是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，可侵染100多科1200多种植物，造成多种具有重要经济价值的植物(农作物、园艺作物等)出现黄化、矮化、畸形等症状，严重影响其产量和品质(Mochizuki et al.,2012)。关于植物病毒病的防治，利用弱毒疫苗进行交叉保护，是一种有效的病毒防治策略，存在期效长、无污染、对环境友好等优点。

对于通过分子生物学手段人工制备的多价弱毒疫苗，由于其在构建时需要插入异源病毒的片段，既要插入一定长度的异源病毒片段以保证潜在的基因沉默对异源病毒的防治效果，同时还要保证弱毒突变体的稳定性(即在插入异源病毒片段后的稳定存在)，相对于抗单独病毒的弱毒疫苗，多价弱毒疫苗的构建难度更大。因此，研究能够容纳更长外源片段的疫苗构建载体，是多价弱毒疫苗构建的重要解决方案。

本发明在前期研究中开发设计了一种2b蛋白翻译提前终止的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCC_FR2-2bPTⅡ，其针对2b蛋白编码序列进行改造获得弱毒突变体。但是，由于病毒对自身尺寸存在包装限制，所以构建多价弱毒疫苗时，插入的外源病毒片段具有长度限制。以pCC_FR2-2bPTⅡ作为基础载体，构建多价弱毒疫苗时，可以容纳200bp外源片段并保持遗传稳定性，插入200bp以上的外源片段时不稳定。为获得多价弱毒疫苗，需要基础载体有较大的容纳外源片段的能力。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体。本发明的突变型质粒可以CMV具有交叉保护效果；其作为疫苗载体，至少可以容纳350bp的外源片段并保持遗传稳定性。以此弱毒疫苗载体为基础，为插入更多种类的外源病毒片段提供了更多选择，为研发多价弱毒疫苗提供了更优化的基础载体。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体，将其命名为pCC_FR2-2bPTⅢ，所述突变型质粒载体含有CMV_Fny分离物突变型RNA2；所述CMV_Fny分离物突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二方面，提供上述含有黄瓜花叶病毒Fny分离物RNA2的突变型质粒载体pCC_FR2-2bPTⅢ的制备方法，包括以下步骤：

以CMV_Fny RNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMV_Fny-R2为模板，利用反向PCR扩增技术获得线性化载体；利用BamHI酶切与连接技术，最终获得载体pCC_FR2-2bPTⅢ。