[发明专利]一种子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法及应用

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法及应用。用酒精浸泡法来进行消毒杀菌，这样就避免了细胞培养时被污染的情况，大大提高了细胞培养的成功率；利用子宫内膜组织块悬浮培养法，可以在间充质干细胞P1代的时候就能将其纯化到98％以上，得到较为原始的高纯度的间充质干细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法及应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早发现于骨髓中，现已证实存在脐带血、脐带、脂肪、胎盘等多种组织中，它一种具有较强的自我更新能力和多向分化能力的成体干细胞。具有很强的免疫调节作用、具有造血支持作用以及促进组织修复作用。子宫内膜来源的间充质干细胞在治疗卵巢早衰、宫腔黏连以及子宫内膜薄引起的不孕症等的妇科疾病中也已经开展了广泛的研究。

一般采用女性经期脱落的子宫内膜组织作为一种优质的间充质干细胞的来源。专利CN201811226089.8提供了一种提取子宫内膜间充质干细胞的方法及其应用，采用的是通过过滤分离将收集脱落的子宫内膜组织，然后剪碎、离心、进行组织贴壁培养出间充质干细胞。此方法的缺点在于，子宫内膜中绝大多数细胞是子宫内膜细胞，贴壁培养时会有大量的子宫内膜细胞贴于瓶底，不利于间充质干细胞的增值，同时使得到的间充质干细胞纯度不高，影响后续使用的效果。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的之一在于提供了一种子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法，解决了现有培养方法中贴壁培养时会有大量的子宫内膜细胞贴于瓶底，不利于间充质干细胞的增值，同时使得到的间充质干细胞纯度不高，影响后续使用的效果的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

一种子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法，所述方法包括以下步骤：

1)子宫内膜的采集：月经期内，采集经血，经过滤并用等渗溶液冲洗后将得到的组织块转移至保护液中；

2)子宫内膜的清洁：将子宫内膜组织用等渗溶液冲洗，剩下白色的子宫内膜组织后再进行杀菌消毒和冲洗；

3)子宫内膜组织的培养：将子宫内膜组织剪成碎块，放入装有完全培养基的培养瓶中悬浮培养，并定时摇晃培养瓶；

4)细胞收集培养：当子宫内膜组织碎块长成光滑的球形时，消化子宫内膜组织并收集细胞进行培养。

进一步，步骤1)，采学时间为月经周期的第二天，所述保护液为含有质量浓度为300～600mg/L青霉素和质量浓度为400～800mg/L链霉素的DMEN/F12培养基。

进一步，组织块转移至保护液中后在4～8℃的条件下12小时内送至实验室进行操作。

进一步，步骤2)，将子宫内膜组织浸泡于75％酒精中20～40秒，进行杀菌消毒，再用生理盐水冲洗子宫内膜组织。

进一步，所述等渗溶液包括生理盐水、D-Hank'S液或PBS。

进一步，步骤3)，所述子宫内膜组织碎块的面积为1mm²，，培养时间为7-10天。

进一步，所述方法还包括以下步骤：

5)消化收集步骤4)培养的细胞为第一代细胞并培养；

6)消化收集步骤5)培养的细胞为第二代细胞并培养；

7)将步骤6)得到的细胞进行传代培养后进行细胞表型鉴定。

进一步，消化采用质量浓度为0.125％～0.25％的胰蛋白酶。