[发明专利]一种定量测定生物样品中利马前列素的方法

说明书

本发明公开了一种定量测定生物样品中利马前列素的方法，采用超高效液相色谱‑差分离子淌度‑四级杆飞行时间高分辨串联质谱分析技术，以m/z 379.2484→299.2380Da作为特征定量离子对，检测限可降低到0.05pg/mL，满足精准分析生物样品中利马前列素要求。通过色谱、差分离子淌度和高分辨质谱三维度分离分析相结合的策略，可降低对液相色谱分离度的要求，缩短了分析时间，提高分析通量。优选连续可变窗口采集技术，设定2Da的窗口跨度，同时采集目标物的一级和二级质谱数据，并结合高分辨率质谱的选择性可进一步提高检测的准确性和选择性，有效避免基质中内源物干扰，减少必需萃取次数，缩短样品处理时间。

技术领域

本发明属于药物分析研究技术领域，涉及测定诸如血浆、组织液、尿液等生物样品中利马前列素的定量分析方法。

背景技术

利马前列素(Limaprost)是人工合成的一种前列腺素E1类似物，由日本小野药品工业公司与大日本制药公司合作研发，1988年分别以商品名OPALMON及PRORENAL上市，其名称为(E)-7-[(1R,2R,3R)-3-羟基-2-[(3S,5S)-(E)-3-羟基-5-甲基-1-壬烯基-5-氧代环戊基]-2-庚酸，分子式C₂₂H₃₆O₅，分子量380.5Da。

由于消化酶的破坏，传统的前列腺素类药物易被分解代谢，一般口服无效，而利马前列素口服后可以发挥药理作用，提高了其临床的适应性，是最早用于循环系统的口服前列腺素类药物。临床应用的利马前列素剂型为利马前列素阿尔法环糊精片，用于血栓闭塞性脉管炎引发的各种缺血性症状，例如溃疡、疼痛以及后天性腰椎管狭窄症伴有的下肢疼痛和麻木等主观症状的治疗。

利马前列素临床使用剂量极低，用于后天性腰椎管狭窄症的给药剂量为5μg，达峰浓度(C_max)仅为2.56pg/mL，这要求利马前列素的定量下限至少达到0.1～0.2pg/mL。同时，体内存在数十倍于利马前列素达峰浓度的内源性化学背景干扰，这是该药物体内分析面临的“瓶颈”问题。

已报道的生物样品中前列腺素类分析方法包括放射标记法、酶联免疫法、色谱-质谱法。其中，放射标记法不能用于人体的药代动力学研究，酶联免疫法选择性较差，难以区分利马前列素与血浆中大量的内源性干扰，气相色谱-质谱法(GC-MS)则需要复杂的衍生化过程。基于多反应监测(MRM)的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)是体内药物分析的首选，但该方法测定血浆中利马前列素的最低定量浓度(LLOQ)仅为0.5pg/mL。目前，能满足利马前列素药代动力学LLOQ的分析方法是二维液相色谱-串联质谱法(2D-LC-MS/MS)。该方法的问题在于：(1)为了降低生物样品的极强的背景干扰，样品处理过程采用了极为复杂的三步固相萃取。为了提高分析方法在生物样品中的选择性，质谱检测器的MRM则是监测了特异性相对较强而信号较弱的反应离子对(m/z 379→233Da)，即便如此，血浆中内源性的干扰仍极强。为此，该方法的色谱分离不得不采用二维色谱进行分离，致使每个样品的分析时间长达50分钟，无法满足本品生物等效性(BE)试验数以千计样本量的分析需求；(2)采用常规的进样量(10-20μL)，该方法的灵敏度无法达到LLOQ。为了提高分析方法灵敏度，该方法不得不采用100μL的超大进样量。如果进行大样本量的生物分析，色谱柱的耐受性将会受到极大的挑战；因此，亟需发明高选择性、高信噪比、高灵敏度、高通量的样品处理和分析新方法，突破利马前列素体内定量分析的技术瓶颈。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，建立一种选择性好、灵敏度和分析通量高的生物样品中利马前列素的定量方法，对生物样品中的利马前列素进行快速、精准定量分析。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。