[发明专利]一种重组毕赤酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种重组毕赤酵母，将来自枯草芽孢杆菌的左聚糖蔗糖酶(Levansucrase)基因克隆到毕赤酵母整合质粒上，得到的重组质粒线性化后转化到宿主毕赤酵母，通过同源重组将左聚糖蔗糖酶(Levansucrase)基因整合到毕赤酵母染色体中，挑选出携带高拷贝外源基因的重组毕赤酵母菌株，即得。本发明能够高效分泌表达耐热型左聚糖蔗糖酶，分泌率约100％，重组酶的最适聚合反应温度提高到45℃，具有良好的耐热性，通过简单离心去除毕赤酵母细胞所得的上清液即可作为酶制剂，用于高分子量左聚糖的生产，产物中分子量约2000kDa的左聚糖组分可占比90％以上，蔗糖转化率达27.8％。

技术领域

本发明涉及微生物重组工程，特别涉及一种重组毕赤酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的方法及其应用。

背景技术

左聚糖(Levan)是一类分子中含有大量β-(2,6)果糖苷键主链和少量β-(2,1)果糖苷键支链的聚糖，左聚糖因具备高水溶性和低固有粘度等独特优良特性，在医药、食品、日化用品等领域应用广泛。其中，高分子量左聚糖具有更好的抑瘤活性而受到人们重视，具有广阔应用价值。

制备左聚糖主要方法有：直接提取、化学合成、微生物发酵及酶法合成，其中酶法合成左聚糖方法简单、纯化方便、产量较高，有利于左聚糖工业化大规模生产，因此寻求分泌型高产左聚糖蔗糖酶菌株成为关键。

毕赤酵母作为高效外源表达系统，具有诱导水平高、自身分泌蛋白少、适合高密度发酵等优点，广泛用于外源蛋白表达。并且毕赤酵母可以实现外源蛋白胞外表达，便于产物分离纯化，大大降低生产成本。目前，毕赤酵母已被美国FDA 认定为GRAS(Generallyrecognized as safe)微生物，可应用于医药食品生产。

虽然毕赤酵母表达系统在产物胞外分泌、修饰加工方面具有天然优势，但外源基因能否在毕赤酵母中高效分泌表达有较大的外源基因依赖性，即不同的外源蛋白常常有不同的分泌效率，并且和信号肽的选用、密码子的改造以及外源蛋白匹配性均相关。此外，来自原核微生物的基因在真核微生物酵母中表达，更是有许多关于蛋白质翻译和后加工导致重组蛋白功能变化的不确定性。因此，目前尚缺乏在毕赤酵母中高效分泌表达左聚糖蔗糖酶的技术报道。左聚糖蔗糖酶可以通过催化聚合反应将蔗糖底物转化为左聚糖，但目前报道的左聚糖蔗糖酶普遍存在聚合反应中酶热稳定性低、所得产物分子量分布不均一的缺点，尤其是缺乏能够产生较均一的高分子量左聚糖的耐热酶。构建能够高效分泌表达耐热左聚糖蔗糖酶的重组毕赤酵母，并用于生产高分子量为主的左聚糖，对于推进左聚糖在化妆品、食品和医疗的产业化应用具有重大意义。

2019年，Hyunjun Ko et al.报道了在酿酒酵母中整合表达来自水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)左聚糖蔗糖酶的研究(Journal of Industrial MicrobiologyBiotechnology(2019)46:1611–1620)，其重组左聚糖蔗糖酶的胞外分泌率达到了63％，作者在研究中表示这是在已有报道中不同种类酵母分泌表达左聚糖蔗糖酶的最高分泌率。然而，该酶以蔗糖为底物生产左聚糖的酶促反应性能较差，其蔗糖转化率仅12.8％，以50％(W/V)的蔗糖底物反应仅能得到59.1g/L的左聚糖产物；并且该酶热稳定性较差，在40℃时酶活力迅速下降。由此可见，高分泌水平表达高性能耐热左聚糖蔗糖酶的技术仍然亟待突破。

发明内容

本发明针对上述现有技术问题，发明一种以整合型重组毕赤酵母高效分泌表达耐热左聚糖蔗糖酶，并用于生产高分子量为主的左聚糖的方法。利用整合质粒将左聚糖蔗糖酶基因整合到毕赤酵母染色体基因组，构建整合型重组毕赤酵母，经发酵过程诱导表达得到耐热左聚糖蔗糖酶。经简单离心去除毕赤酵母细胞，得到的上清液即可作为左聚糖蔗糖酶制剂，可直接用于高分子量左聚糖的生产。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：