[发明专利]高特异RPA/RAA检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开一种高特异RPA/RAA产物检测试剂盒及检测方法，该方法是在RPA/RAA反应体系中引入flap核酸内切酶及针对靶标设计的一对上下游寡核苷酸探针和荧光报告发夹探针，当核酸待测靶标被重组酶聚合酶扩增得到产物后，所述上下游探针会与所述扩增产物杂交形成flap核酸内切酶识别与切割的底物，进而引发级联切割反应将荧光标记发夹探针切割产生荧光信号，实现对RPA/RAA产物的识别与报告，通过记录实时荧光曲线或肉眼直接观察管内荧光的方式进行检测。该方法提高了传统重组酶聚合酶扩增检测方法的特异性，能达到单碱基分辨率，避免了传统重组酶聚合酶扩增镁离子预混在反应体系中特异性差的弊端，是一种更加便捷、特异的重组酶聚合酶核酸扩增检测方法。

技术领域

本发明专利涉及高特异RPA(重组酶聚合酶扩增)/RAA(重组酶介导的扩增)检测试剂盒及其检测方法，属于核酸检测领域。

背景技术

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)自2006年开发以来被誉为“可替代PCR的犀利技术”,可实现在37～42℃恒温条件下孵育10～30min完成靶标核酸的指数扩增，彻底摆脱了PCR反应对于精密热循环仪等设备的依赖。重组酶介导的扩增技术(RAA)反应原理与RPA相同，都是依赖重组酶、DNA聚合酶和单链结合蛋白在恒温条件下进行核酸快速扩增。两者唯一的不同在于，RPA的重组酶来源于T4噬菌体，RAA的重组酶来源于细菌或真菌。正是由于快速灵敏、对设备要求低等优势，RPA/RAA技术广泛应用于现场即时检测(Point-of-caretesting，POCT)。

虽然RPA/RAA产物的检测方法多种多样，但适合于POCT的灵敏特异、快速便捷的产物检测方法却亟待开发。传统的凝胶电泳检测法操作繁琐，尤其是开管操作易产生交叉污染，不适于现场快速检测。荧光探针法是目前RPA/RAA产物检测最常用的方法，它是在RPA/RAA体系中加入核酸酶和特定的检测探针(如exo检测、fpg检测),利用探针特异性识别扩增产物进而引发核酸酶切割探针产生荧光信号，实时监测RPA/RAA扩增产物，产生类似于荧光定量PCR中的荧光扩增曲线，实现对待测靶标的高特异检测。然而，RPA/RAA反应的定量性能无法与PCR媲美，这主要由于RPA/RAA扩增完全依赖多种酶促反应的速率，其扩增动力学不像PCR那样完全依赖于反应循环数，所以很难通过扩增抬起时间对靶标进行定量。因此，采用实时荧光法监测RPA/RAA反应不仅增加了仪器成本，而且难以准确定量，并不是RPA/RAA检测的理想方法。近年来，微流控芯片技术异军突起，多篇文章将其应用于RPA/RAA的现场快速检测，但是由于Exo检测法对反应组分的加入次序有严格要求且不适于荧光信号的终点检测，无疑对于微流控技术提出了更高的要求。虽然采用侧流层析试纸条技术可对RPA/RAA产物进行可视化检测，但开管操作易产生交叉污染，尽管利用一次性卡套装置可实现在封闭的腔体内完成试纸条检测过程，降低了交叉污染的风险，但每管RPA/RAA产物均需额外的卡套装置无疑增加了耗材成本。

基于光电或是化学发光的独特RPA/RAA检测方法一定程度上可实现高灵敏、高特异或是可视化检测，但这些方法仍需要依赖独特的光电设备或是需要开管洗涤，无疑也会限制RPA/RAA技术在POCT领域的推广与使用。此外，现有RPA/RAA产物检测方法的特异性不够好，尽管将基于Cas12a或Cas13a蛋白的探针酶切方法(如DETECTR和SHERLOCK)用于RPA/RAA产物检测可提高特异性，但这些技术步骤较多，依然需要开管检测。

因此，亟需开发一种闭管、高特异RPA/RAA扩增检测方法，无需特殊昂贵且大型的设备，通过简单操作和便携设备即可实现高灵敏、高特异性的快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种高特异RPA/RAA检测试剂盒。

本发明采用的技术方案为：

一种高特异RPA/RAA检测试剂盒，包括重组酶、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白，其特征在于：还包括上游寡核苷酸探针(UP探针)、下游寡核苷酸探针(DP探针)、发夹探针及flap核酸内切酶；