[发明专利]高特异RPA/RAA检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种高特异RPA/RAA检测试剂盒，包括重组酶、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白，其特征在于：还包括上游寡核苷酸探针、下游寡核苷酸探针、发夹探针及flap核酸内切酶；

所述下游寡核苷酸探针设计为3’端与靶标序列互补，5’端与靶标序列不互补，所述上游寡核苷酸探针与靶标序列互补，上游寡核苷酸探针的3’末端单个碱基侵入到下游寡核苷酸探针与靶标杂交的双链区域，形成flap核酸内切酶识别底物，flap核酸内切酶切割释放出下游寡核苷酸探针5’端与靶标不互补的部分；

所述发夹探针上标记有荧光基团与淬灭基团，下游寡核苷酸探针5’端与靶标不互补的部分与发夹探针互补，侵入到发夹探针5’双链区域，再次形成flap核酸内切酶识别底物，flap核酸内切酶酶切使荧光基团与淬灭基团分离。

2.根据权利要求1所述的高特异RPA/RAA检测试剂盒，其特征在于：所述flap核酸内切酶为：Afu FEN1、Pfu FEN1、Mja FEN1或Mth FEN1。

3.根据权利要求2所述的高特异重组酶聚合酶核酸扩增检测试剂盒，其特征在于：所述flap核酸内切酶为Afu FEN1。

4.根据权利要求1所述的高特异RPA/RAA检测试剂盒，其特征在于：所述发夹探针5’端标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、Cy5或Cy3，所述淬灭基团选自DABCYL、ECLIPSE、TAMRA或BHQ。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的高特异RPA/RAA检测试剂盒，其特征在于：所述发夹探针上的荧光基团和淬灭基团间隔1～6个碱基,flap核酸内切酶的酶切位点在间隔碱基上。

6.根据权利要求1所述的高特异RPA/RAA检测试剂盒，其特征在于：RPA/RAA检测试剂盒包含以下成分：120ng/μL T4 UvsX蛋白、60ng/μL T4 UvsY蛋白、600ng/μL T4 gp32蛋白、30ng/μL Bsu聚合酶或8～13ng/μL Sau聚合酶、800μM脱氧核糖核苷酸(dNTP)、150nM～600nM上下游寡核苷酸扩增引物、5％聚乙二醇35000、2mM二硫苏糖醇、50mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶、3mM三磷酸腺苷、pH7.9的50mM Tri-醋酸、20～100mM乙酸钾、14mM乙酸镁、0.1～0.5μM上下游寡核苷酸探针与发夹探针、50～500ng/μL flap核酸内切酶。

7.一种高特异RPA/RAA检测方法，其特征在于其步骤包括：

(1)根据待测靶标的DNA序列设计寡核苷酸引物、上游寡核苷酸探针、下游寡核苷酸探针及发夹探针并合成，提取待测样本的基因组DNA；

(2)在待测样本的基因组DNA中加入权利要求1-6中任一项所述的高特异RPA/RAA检测试剂盒中的重组酶、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、上游寡核苷酸探针、下游寡核苷酸探针、发夹探针及flap核酸内切酶，控制温度先进行DNA扩增反应；

(3)待DNA扩增反应完成后，调整温度，进行flap核酸内切酶切割反应，检测反应过程中是否有荧光信号发生，若检测到荧光信号则说明待测样本中存在靶标DNA。

8.根据权利要求7所述的高特异RPA/RAA检测方法，其特征在于：步骤(2)中扩增反应的温度为30～45℃。

9.根据权利要求8所述的高特异RPA/RAA检测方法，其特征在于：步骤(2)中扩增反应的时间为10～30min。

10.根据权利要求7所述的高特异RPA/RAA检测方法，其特征在于：步骤(3)中flap核酸内切酶切割反应的温度为63℃，步骤(3)中flap核酸内切酶切割反应的时间为5～30min。