[发明专利]一种用于磷酸化蛋白质组学的在线自动化分析装置和分析方法

说明书

本发明公开了一种用于磷酸化蛋白质组学的在线自动化分析装置和分析方法。它为液相色谱‑质谱联用仪，所述的液相色谱包括磷酸化肽捕获柱和分析柱，所述的磷酸化肽捕获柱是ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱；将钾水玻璃、γ‑缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷和水溶解的三磷酸腺苷二钠混合搅拌，然后加入用水溶解的甲酰胺搅拌获得反应液，将反应液注满色谱柱，然后注满的色谱柱的反应液反应固化，再经洗涤，获得ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱。本发明的首要优势是将研究人员从富集磷酸化肽所需的上金属离子、上样、洗涤、洗脱、除盐、挥干、复溶等繁杂人力操作中解放出来，提升了实验效率。

技术领域

本发明属于色谱和质谱领域，具体涉及一种在纳升级液相色谱-质谱仪上进行磷酸化多肽自动化在线分析的用于磷酸化蛋白质组学的在线自动化分析装置和分析方法。

背景技术

许多重要的生命调节过程与蛋白质的磷酸化有关，对细胞中蛋白质的磷酸化事件进行定性定量分析，有助于揭示磷酸化修饰蛋白在信号通路中的调控机制，挖掘关键基因或指导药物研发的靶点。液相色谱-高分辨质谱联用仪结合bottom-up分析策略是当前蛋白质组学研究的核心方法，然而由于磷酸化肽的丰度极低、电离效率差以及受到非磷酸化肽的信号抑制，使得从全蛋白酶切物中直接分析磷酸化肽非常困难，在分析之前从酶切样品中对磷酸化肽进行选择性富集是必不可少的操作。

固定化金属离子亲和层析(IMAC)是磷酸化蛋白质组学中最主要的富集技术，螯合配体如亚氨基二乙酸(IDA)和次氮基三乙酸(NTA)可将金属阳离子(如Cu²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺或Ga³⁺等)固定在固相基质表面，这些固定化金属离子可以与多肽的磷酸基团通过路易斯酸碱相互作用而结合，从而从全蛋白酶切物中富集磷酸化肽，后者随后被碱性的缓冲液洗脱下来，再经过酸化、除盐、浓缩等步骤后才能进行质谱分析。由于IMAC通常为微球、磁性材料或微量柱的形式，故上述流程需通过涡流、离心/磁吸或移液器吸打的方式手动进行，比较耗时耗力，且繁琐的人工操作难免会造成较大的误差或者错误。

一种解决上述问题的思路是发明一种色谱柱形式的IMAC，可与液相色谱系统相结合，通过对液路的合理设计及对自动进样器、十通阀和流动相的控制，或许能实现自动化的磷酸化肽富集、分析。在实际的蛋白质组学分析任务中使用的是纳升级液相色谱-质谱联用仪，而开发纳升级的磷酸化肽富集柱往往会遇到背压过高、上样率低、灵敏度差等难题，另一大难点是将磷酸化肽从捕获柱洗脱需要高pH溶液，与后续C18分析柱的上样条件不兼容，最后，如何设计液相系统的连接以及自动化分析程序也是技术难题，故目前尚无商品化的装置可用于磷酸化蛋白质组的在线、自动化分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于磷酸化蛋白质组学的在线自动化分析装置。

本发明的用于磷酸化蛋白质组学的在线自动化分析装置，其为液相色谱-质谱联用仪，所述的液相色谱包括磷酸化肽捕获柱和分析柱，其特征在于，所述的磷酸化肽捕获柱是ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱；

所述的ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱的制备方法为：

将钾水玻璃、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷和水溶解的三磷酸腺苷二钠混合搅拌，然后加入用水溶解的甲酰胺搅拌获得反应液，将反应液注满色谱柱，然后注满的色谱柱的反应液反应固化，再经洗涤，获得ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱。

本发明的ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱的制备原理示意图如下所示：

1、钾水玻璃的制备

mKOH+nSiO₂→mK₂O·(n-m)SiO₂+mH₂O

2、钾水玻璃在甲酰胺、加热条件下水解