[发明专利]一种用于磷酸化蛋白质组学的在线自动化分析装置和分析方法

权利要求书

1.一种用于磷酸化蛋白质组学的在线自动化分析装置，其为液相色谱-质谱联用仪，所述的液相色谱包括磷酸化肽捕获柱和分析柱，其特征在于，所述的磷酸化肽捕获柱是ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱；

所述的ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱的制备方法为：

将钾水玻璃、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷和水溶解的三磷酸腺苷二钠混合搅拌，然后加入用水溶解的甲酰胺搅拌获得反应液，将反应液注满色谱柱，然后注满的色谱柱的反应液反应固化，再经洗涤，获得ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱；

所述的钾水玻璃、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、三磷酸腺苷二钠盐和甲酰胺的用量质量比是500-2000:1-10:2-50:20-130。

2.根据权利要求1所述的在线自动化分析装置，其特征在于，所述的钾水玻璃、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、三磷酸腺苷二钠盐和甲酰胺的用量质量比是1000:6:7.5:68；所述的钾水玻璃的模数范围2-4，波美度范围为20-50。

3.根据权利要求2所述的在线自动化分析装置，其特征在于，所述的钾水玻璃的模数3.3，波美度为40。

4.根据权利要求1所述的在线自动化分析装置，其特征在于，所述的固化是在温度100℃下固化10小时；所述的洗涤是先后用1M 硝酸铵、0.1M硝酸和水洗涤。

5.根据权利要求1所述的在线自动化分析装置，其特征在于，所述的色谱柱是弹性石英毛细管。

6.根据权利要求5所述的在线自动化分析装置，其特征在于，所述的弹性石英毛细管是外径360微米、内径150微米、长度15厘米的弹性石英毛细管。

7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的在线自动化分析装置，其特征在于，所述的用于磷酸化蛋白质组学的在线自动化分析装置，包括上样部分和分析部分，所述的上样部分包括第一组流动相储液瓶、第二组流动相储液瓶、脱气机、上样泵、自动进样器、磷酸化肽捕获柱，所述的分析部分包括NC泵、C18预柱、十通阀、C18分析柱、nano-ESI和高分辨质谱仪，所述的第一组流动相储液瓶、脱气机、上样泵、自动进样器中的六通阀、磷酸化肽捕获柱和十通阀通过管道顺序相连，六通阀上还设有定量环与六通阀的两个通道相连，自动进样器中还设有样品盘和注射器分别与六通阀相连，第二组流动相储液瓶、NC泵和十通阀通过管道顺序相连，在十通阀上还设有C18预柱，C18预柱与十通阀通过管道相连，十通阀还与C18分析柱相连，C18分析柱出口端能与nano-ESI和高分辨质谱仪顺序相连，十通阀还连有废液瓶。

8.一种用于磷酸化蛋白质组学的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、磷酸化肽捕获柱经ZrCl₄洗脱，使得ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱填料螯合Zr⁴⁺；

B、取样品流经步骤A的磷酸化肽捕获柱，完成对磷酸化肽的富集；

C、清洗液流经步骤B的磷酸化肽捕获柱，完成对非特异性结合多肽的清洗；

D、洗脱液流经步骤C的磷酸化肽捕获柱，对富集的磷酸化肽进行洗脱，洗脱的磷酸化肽进入C18预柱；

E、用流动相洗脱C18预柱，磷酸化肽进入C18分析柱、再经质谱仪鉴定；

所述的磷酸化肽捕获柱，其制备方法包括将钾水玻璃、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷和水溶解的三磷酸腺苷二钠混合搅拌，然后加入用水溶解的甲酰胺搅拌获得反应液，将反应液注满色谱柱，然后注满的色谱柱的反应液反应固化，再经洗涤，获得ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱；其中钾水玻璃、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、三磷酸腺苷二钠盐和甲酰胺的用量质量比是500-2000:1-10:2-50:20-130。

9.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于，使用权利要求7所述的在线自动化分析装置，步骤为：

S1. 自动进样器中的进样瓶中分别装有0.1M ZrCl₄；样品溶液；洗涤液：体积分数80%ACN、1%TFA；洗脱液：1M NH₄H₂PO₄；清洗液：体积分数40% ACN、5%NH₄OH；

S2. 自动进样器吸取0.1M ZrCl₄进入定量环，六通阀切阀，在上样泵推动下流经磷酸化肽捕获柱→十通阀→废液瓶，上样泵流动相为体积分数0.1% FA，NC泵控制的流动相体积分数80% ACN、0.1% FA流经十通阀→C18预柱→十通阀→C18分析柱；

S3. 将样品溶解于体积分数80% ACN、1% TFA的溶液中，自动进样器吸取样品溶液进入定量环，六通阀切阀，在上样泵推动下流经磷酸化肽捕获柱→十通阀→废液瓶，上样泵流动相为体积分数0.1% FA，NC泵控制的流动相体积分数80% ACN、0.1% FA流经十通阀→C18预柱→十通阀→C18分析柱；

S4. 自动进样器吸取洗涤液体积分数80% ACN、1% TFA进入定量环，六通阀切阀，在上样泵推动下流经磷酸化肽捕获柱→十通阀→废液瓶，上样泵流动相为体积分数0.1% FA，NC泵控制的流动相体积分数0.1% FA流经十通阀→C18预柱→十通阀→C18分析柱；

S5. 十通阀切阀，自动进样器吸取洗脱液1M NH₄H₂PO₄进入定量环，六通阀切阀，在上样泵推动下流经磷酸化肽捕获柱→十通阀→C18预柱→十通阀→废液瓶，上样泵流动相为体积分数0.1% FA；NC泵控制的流动相体积分数0.1% FA流经十通阀→C18分析柱；洗脱后，十通阀切阀，让NC泵的流动相A体积分数0.1%甲酸，2%乙腈流经十通阀→C18预柱→十通阀→C18分析柱，继续冲洗除盐；

S6. 十通阀切阀，自动进样器吸取清洗液体积分数40%乙腈、5%NH₄OH进入定量环，六通阀切阀，在上样泵推动下流经磷酸化肽捕获柱→十通阀废液瓶，上样泵流动相为体积分数0.1% FA，同时开启质谱检测；NC泵控制的流动相体积分数40%ACN、0.1% FA流经十通阀→C18预柱→十通阀→C18分析柱→喷针→nano ESI源，用质谱仪检测。